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第七章免疫学技术免疫•主动免疫•被动免疫主动免疫与被动免疫的比较主动免疫被动免疫输入物质抗原（疫苗）抗体免疫后生效时间1—4周后立即生效免疫力维持时间数周—数年1—2周用途多用于预防用于治疗或紧急预防常用的生物制剂•1、活疫苗•2、灭活疫苗•3、抗血清/蛋黄抗体•4、诊断试剂活疫苗和灭活疫苗的比较活疫苗灭活疫苗制剂特点无毒或弱毒株、活强毒株、灭活接种量量较小量较大保存及有效期不易保存较易保存免疫效果产生快、持续时间短产生慢、持续时间较长特异性抗体•1、抗血清•2、蛋黄抗体新型疫苗•1、亚单位疫苗•2、合成疫苗•3、基因工程疫苗•4、口服疫苗•5、DNA疫苗免疫调节剂(immunomodulator)增强、促进和调节机体免疫功能的一类生物或非生物制剂。该种制剂的调节作用通常表现为对机体的正常免疫功能不产生影响，而对异常的免疫功能具有双向调节作用，即在一定范围内对过低的免疫应答起促进作用，对过高的免疫应答起抑制作用。免疫调节剂的种类•1、微生物制剂•2、免疫组织提取物•3、细胞因子•4、化学合成制剂微生物制剂•1、卡介苗(牛型结核杆菌减毒活疫苗)•2、棒状杆菌(革兰氏阳性短小棒状杆菌)•3、脂磷壁酸(溶血型链球菌菌体表面具有免疫增强作用的成分)•4、胞壁酰二肽(分枝杆菌细胞壁中的一种具有免疫增强和佐剂作用的成分)•5、细菌脂多糖微生物制剂的主要作用•1、激活单核吞噬细胞，增强其吞噬杀菌和细胞毒作用。•2、诱导单核细胞释放细胞因子(IL-1、IL-2、IFN、CSF等)，促进和调节免疫应答。•3、促进TH细胞发生分裂，诱导TH细胞产生IL-2、4、6，TNF和IFN等多种细胞因子，促进或调节免疫应答。•4、增强NK细胞杀伤能力，促进造血干细胞成熟。免疫组织提取物——胸腺激素•从动物胸腺中提取的一组可溶性多肽混合物，主要包括：胸腺素、胸腺生成素、胸腺刺激素。•能够促进胸腺中未成熟的T细胞发育分化为具有免疫活性的T细胞，并可选择性地作用于T细胞分化的某些环节，增强T细胞的免疫功能。细胞因子•相对分子量较低的蛋白或糖蛋白，主要由活化的免疫细胞或其他非免疫细胞产生，常以自分泌或旁分泌方式在局部发挥免疫调节作用。•IL-2•IFN•TNF化学合成制剂•1、左旋咪唑：第一个化学结构明确的免疫调节剂，对机体细胞免疫功能有明显的调节作用。•2、合成多聚核苷酸：人工合成的多聚核苷酸的双链共聚物，主要包括polyI:C和polyA:U。polyI:C具有免疫佐剂作用，是作用最强的干扰素诱生剂，能刺激机体产生干扰素。常用的家禽免疫程序（三黄鸡）三黄鸡参考免疫程序日龄疫苗剂量接种方法1马立克CVI9881头份颈部皮下注射1-3新支二联苗2头份滴眼10ND+H9+H5油苗0.3ml颈部皮下注射12IBD苗1头份滴口或饮水15NDI系1.5头份肌注25IBH52苗2头份饮水30ILT苗1头份单边点眼或饮水45ND+H9+H5油苗0.5ml肌注70NDI系2头份肌注100NDI系3头份肌注常用的家禽免疫程序(种、蛋鸡)天龄疫苗名称剂量方法1马立克CVI9881头份颈部皮下注射1-3新支二联苗2头份滴眼10ND+H9+H5油0.5ml颈部皮下注射鸡痘1头份翼蹼刺种12IBD苗1头份滴口或饮水15NDI系苗1.5头份肌注25IBH52苗2头份饮水30ILT苗1头份单边点眼或饮水45-50NDI系2头份分两侧胸肌注射常用的家禽免疫程序(种、蛋鸡)天龄疫苗名称剂量方法60IBH52苗2头份饮水IC苗1头份肌注85AE+大鸡痘1头份刺种90H5+H9油苗0.5ml肌注105ILT苗1头份饮水115IC油苗1头份肌注120ND+IB+EDS油苗0.5ml肌注Ⅳ系苗3头份饮水130H5+H9油苗0.5ml肌注38-40WH5油苗0.3-0.5ml肌注疾病诊断中的免疫学技术•1、抗原-抗体特异性结合反应•2、判定细胞免疫功能状态免疫球蛋白的结构轻链(L)重链(H)抗原结合位点FcFabVHVLCLCH抗原-抗体结合的结构基础1、VL和VH在具有不同抗原特异性的各种抗体中是多种多样的，而主要的变异发生在高变区。2、高变区形成暴露在抗体表面的外展环形结构，并能以此与抗原相互作用。3、高变区的氨基酸序列决定抗原结合的特异性，高变区发生的突变，可以改变抗原结合特异性。抗原抗体反应的一般规律和特点•1、高度特异性•2、表面可逆性结合•3、适当的浓度和比例•4、特异性结合的两个阶段(1)特异性结合阶段：反应快、肉眼不可见。(2)可见阶段：所需时间长，肉眼可见。影响抗原抗体反应的主要因素•1、电解质：0.85%NaCl溶液。•2、温度：37C是最适温度。•3、酸碱度：pH6-8。抗原抗体反应的基本类型•1、沉淀反应•2、凝集反应•3、中和试验•4、免疫标记技术免疫沉淀反应免疫沉淀反应是建立在可溶性抗原和抗体在液相中特异结合的反应。这种结合分两个阶段：1、抗原-抗体特异性结合阶段，从几秒中到几分钟之内完成，形成可溶性的小复合物。2、第二阶段形成大的、可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时。琼脂扩散试验属于免疫沉淀技术的一种，常用的是双向扩散试验。以琼脂凝胶为介质，在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原-抗体沉淀线。观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出抗原或抗体的定性分析。双向免疫扩散基本图形AgAb凝集试验细菌和红细胞等颗粒抗原，与相应抗体结合后，可出现肉眼可见的凝集现象。凝集反应的发生分两个阶段：1、抗原-抗体的特异性结合；2、出现可见的颗粒凝集。特点：灵敏度高，操作简便。直接凝集反应细菌、螺旋体、红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下，可直接与相应抗体结合出现凝聚现象，称为直接凝集反应。反应中的抗原叫作凝集原，抗体称为凝集素。常用的有玻片法和试管法。玻片凝集示意图不凝集（—）凝集（+）肉眼所见镜下所见直接凝集反应——试管法•试管法为定量试验，多用于检测抗体。先将备检血清在试管内用生理盐水作连续2倍稀释，然后于各管内加入等量已知抗原，经一定时间后观察凝集的程度，判定血清中抗体的效价，以表示血清中抗体的相对含量。间接凝集反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适当电解质存在的条件下，出现的特异性凝集现象，叫作间接凝集反应，或被动凝集反应。间接凝集反应示意图载体颗粒可溶性抗原致敏颗粒抗体致敏颗粒凝聚中和试验•毒素、酶、激素和病毒等与相应抗体结合，使之丧失生物学活性的现象。引起中和反应的抗体称为中和抗体。中和试验主要包括病毒中和试验和毒素中和试验。病毒中和试验•病毒在细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验，用来检测血清中相应中和抗体的滴度，也可用来鉴定病毒。标记免疫技术免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即以制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。如果将试剂抗原或试剂抗体用可以微量测定的标记物（放射性同位素、荧光素、酶）进行标记，则在与标本中的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的灵敏度，这种方法成为标记免疫技术。酶(放射)免疫分析技术原理Ab+AgAg-Ab+Ag-E[Ag-E]-Ab催化SP(显色）酶免疫分析技术与放射免疫分析的比较1、EIA没有放射性污染，但某些底物具有致癌作用。2、EIA分析仪器简单、价格便宜。3、酶标底物保存时间长。4、酶标记物应用范围广。5、EIA与RIA灵敏度相当。细胞免疫检测技术•1、T细胞及其亚群的鉴定和检测•(1)E玫瑰花环形成试验•(2)T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的检测•2、B细胞鉴定和检测•3、T细胞功能检测•(1)淋巴细胞转化试验•(2)淋巴细胞参与的细胞毒性试验•4、B细胞功能检测E玫瑰花环形成试验•可用于T细胞的检测和鉴定。外周血T淋巴细胞表面具有绵羊（鸡、马等）红细胞受体，将红细胞与外周血淋巴细胞按一定比例混合，在4C条件下放置1—2小时，可形成以T细胞为中心、周围环绕(绵羊)红细胞的花环样细胞集团。可形成E玫瑰花环的细胞为T细胞。T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的检测•T细胞单克隆抗体可用于T细胞及其亚群的检测和鉴定，所用的单克隆抗体主要有CD3McAb、CD4McAb和CD8McAb。•通常采用免疫荧光间接法测定。T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的检测•淋巴细胞中，被CD3McAb着染荧光的细胞为总T细胞，包括TH、TH1、TH2、TC和TS细胞。被CD4McAb着染荧光的细胞为TH、TH1、TH2，被CD8McAb着染荧光的细胞为TC和TS细胞。•结果表示为：CD3+T细胞=？CD4+T细胞=？CD8+T细胞=？B细胞鉴定和检测•SmIgM/D是B细胞表面特有的标志，通过对该种标志的检测，可对B细胞进行鉴定和检测。•通常采用免疫荧光直接法进行测定。即用荧光素标记的(兔)抗IgM/D抗体对外周血淋巴细胞进行直接免疫荧光染色，着染荧光的细胞为B细胞。淋巴细胞转化试验•T细胞在体外受到特异性抗原或非特异性有丝分裂原刺激后，能转化为体积较大、代谢旺盛并能分裂的淋巴母细胞。根据其转化程度和转化率，可测定机体细胞免疫功能状态。淋巴细胞转化试验——非特异性转化试验•用植物凝集素(PHA)或刀豆球蛋白A(ConA)等有丝分裂原刺激多克隆T细胞，使其发生母细胞转化。正常人T细胞转化率约为70%。淋巴细胞转化试验——特异性转化试验•用特异性抗原刺激相应抗原特异性T细胞，使其发生母细胞转化。其转化率明显低于非特异性转化率，一般为5—30%。淋巴细胞转化试验——方法•取外周血或分离的淋巴细胞，加入促有丝分裂原或特异性抗原，在培养液中培养72小时，经涂片、染色后镜检。可通过淋巴细胞形态学变化计算出转化百分率。