流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ulPBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA量分析1个细胞增殖群时，可将DNA含量分布组方图分为三部分，即G0/1、S、G2M。G0/1和G2M细胞峰的DNA分布均为正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布↓检测结果刻录光盘保存↓关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。1、纵坐标CellNumber：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNAContent：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：DipG1-53.84%at55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；DipG2-5.64%at107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；AnnexinV-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-实验步骤：取对数生长期的细胞，按1×106cells/mL以1mL接种于培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加入药物）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）↓加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）↓倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）↓将细胞悬液移入15ml离心管中↓2000rpm离心5min,PBS吸除↓用PBS清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）↓用400ul1×BindingBuffer悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)↓在细胞悬液中加入5ulAnnexinV-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15min↓加入10ulPI后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5min↓在1h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm双波长激发，Em.=510nm检测EGFP荧光(FL1channel)和575nm的发射波长检测PI。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（AnnexinV-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为AnnexinV+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现AnnexinV+/PI-。