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流式细胞术的原理及应用无锡二院检验科流式细胞术的基本概念流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段，能够快速、精确的对单个细胞或颗粒的物理和化学特性（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞术的特点（1）流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。（2）测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞仪的检测范围细胞结构•细胞大小•细胞颗粒度•DNA含量与细胞周期•RNA含量•蛋白质含量•……细胞功能·细胞表面/胞浆/核的特异性抗原·细胞活性·细胞内/外的细胞因子·激素结合位点·细胞受体·钙离子浓度·线粒体膜电位·……一、流式细胞仪的工作原理采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。1.流式细胞仪的基本结构（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统（1）液流系统单细胞悬液大多数仪器检测范围是在50-300µm大小。将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,称为流体动力学聚焦液流系统示意图（2）光学系统由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片和光电倍增管组成。FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细胞仪光学显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机人工结果多参数，高通量综合分析简单，单参数二、散射光的测量细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。前向散射光（FS）前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。前向散射光示意图FALSSensorLaser前向散射光侧向散射光（SS）侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。侧向散射光示意图FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光光散射测量的用途测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群三、荧光的测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。荧光染料的特性•激发波长(EXCITING)•发射波长(EMISSION)荧光信号的检测使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光补偿5ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7四、细胞分选原理通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。细胞分选示意图细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电五、数据的显示与分析参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术（一）参数说明FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少以及荧光种类（二）数据显示方式直分析方图单参数直方图双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析1.单参数直方图由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。单参数直方图细胞相对数量信道(channel)2.双参数直方图双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度（三）设门分析技术1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门2.区阈（Region设置）:如十字门分析时，由四个区阈构成，即G=D1+D2+D3+D4。D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+（1）淋巴细胞亚群检测：CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19免疫功能的变化监测，AIDS（2）HLA-B27:强直性脊柱炎（3）白血病免疫分型：白血病的分类（4）贫血的鉴定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗体(5)………..六、流式细胞术的临床应用七、流式细胞仪的科研应用细胞周期的分析干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术在免疫检验中的应用DNA细胞周期分析SG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)PI染色检测细胞周期Protocol离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜，或-200C长期固定。细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙锭（PI），100ug/mlRNaseA,0.2%TritonX-100)40C避光孵育30分钟。流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软件Modfit分析。细胞凋亡的检测细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)线粒体跨膜电位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰丝氨酸外化(AnnexinV-FITC/PI)Ca2+浓度升高(Fluo-3）DNA断裂及含量的变化(TUNEL和PI）Annexin-V和PI双染protocol细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（bindingbuffer）中以1x106细胞/mL的浓度重悬吸取100ul的细胞(1x105)至试管中。加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温下进行）孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。Annexin-V和PI双染的特点和注意事项检测特点：简便，快速，准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。注意事项：1.细胞制备（如贴壁细胞）和储存时细胞膜的破损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变，造成假阳性。2.染色后立即上机检测。Q3:正常细胞；Q4：早期凋亡细胞；Q2：晚期凋亡细胞；Q1：坏死细胞。对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜