流式细胞分析技术

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王也飞流式细胞分析技术上海交通大学医学院分析细胞学年轻的交叉学科定量细胞学细胞生物学的一个重要分支上海交通大学医学院与之相关的科学技术激光技术数字计算机技术电子物理技术电子摄像技术光电测量技术荧光细胞化学技术单克隆抗体技术等上海交通大学医学院-细胞的形态学参数-生物学特征-细胞化学成分及含量-细胞的功能从定量的角度研究上海交通大学医学院概念流式细胞仪(FlowCytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术(FlowCytometry,FCM)利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。FALSSensorLaser上海交通大学医学院流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术上海交通大学医学院FCM还可在对样品细胞多参数分析测定的基础上,结合多种细胞生物学特性,将样品中特定的细胞亚群高纯度地分选(sorting)出来(活细胞点对点分选),单独收集以供进一步深入研究如:形态学检查、细胞功能研究、细胞培养、分子生物学研究上海交通大学医学院流式细胞发展史1930年,Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数。1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。(从固定式细胞分析-流动式)1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功的设计红细胞光学自动计数器。同年,Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形。1965年,Kamemtsky等提出两个设想,一是用分光光度计定量细胞成分;二是结合测量值对细胞分类。1967年,Kamentsky和Melamed在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法。上海交通大学医学院流式细胞发展史1969年,VanDilla,Fulwyler及其同事们在LosAlamos,NM(即现在的NationalFlowCytometryResourceLabs)发明第一台荧光检测细胞计。1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。1973年,BD公司与美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACSI。从此,大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪,流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。1979年,SSMU:FCM推广1980年,BJNU:国内第一台FCM(FACSIII)进入九十年代,流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善,而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今,流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域,并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。上海交通大学医学院BDFACSCantoII上海交通大学医学院讲课内容基础理论1细胞样品制备技术2在医学生物学中的应用3上海交通大学医学院(一)FCM仪器的一般结构细胞流动室及其液流驱动系统(Z)激发光源及其光束成形系统(X)细胞信号检测(Y)分析、显示、记录系统Z细胞流轴线Y细胞荧光信号检测轴线X激发光轴线基础理论上海交通大学医学院FCM从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。上海交通大学医学院(1)流动室与液流驱动系统流动室(FlowChamber/FlowCell)是流式细胞仪的核心部件。被检样品的细胞悬液流经流动室时,由液体动力学层流技术保证,其中的细胞一个一个排列成单行,逐个依次通过检测区流动室也可称为单细胞流发生器上海交通大学医学院层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数dρVRe=2300,η式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数,d和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.上海交通大学医学院上海交通大学医学院InjectorTip荧光信号激光束鞘液流动室(FlowChamber)通过流动室后细胞一个一个排列成单行,依次通过检测区.把流动室称为单细胞流发生器.流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。上海交通大学医学院液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。上海交通大学医学院液流驱动系统(示意图)流速与压力的关系服从Bernoulli方程,即P=(1/2)V2(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。上海交通大学医学院BDFACSCantoII液流系统上海交通大学医学院(2)激发光源与光束成形系统激光(Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一种相干光源。单波长,高强度,高稳定性FCM的激发光源大多采用氩离子气体激光器(488nm),一些FCM也配有其他各种激光器,如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染料激光器和半导体激光器等。一般选配2-4根激光,488nm、633nm和355nm、407nmUV激光上海交通大学医学院为实现单个细胞的均匀照射,FCM一般都采用二块相互垂直放置的柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透镜所组成的光束成形系统对激光束进行适当的聚焦,形成截面为椭圆形的照射光斑。此光斑正处于FCM仪器中三条正交轴线的交点,即仪器的检测区。上海交通大学医学院球透镜和柱面透镜:20×200m椭圆形光斑,短轴和细胞流平行,长轴与细胞流垂直。光束成形与细胞受照方式上海交通大学医学院激发光焦斑这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照FCM的单细胞照明技术.光束成形与细胞受照方式上海交通大学医学院(3)细胞信号检测与分析处理系统样品细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射,同时产生细胞的散射光信号和细胞的荧光信号。这些信号以被检细胞为中心向空间360度立体角发射上海交通大学医学院细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所使用的荧光素种类近年来荧光素化学技术发展很快,现已可做到用一束激光(488nm)激发三种染料(甚至四种或更多染料)而得到各自波长不同的荧光。这已能满足目前大多数研究和临床检验工作的需要上海交通大学医学院光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值,所产生的荧光信号愈强。若激发光波长都是488nm,而发射光波长又不是极其接近的话,即可同时检测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。对于有较高水平自发荧光类型的细胞,如长期组织培养的细胞,应使用较高发射波长的荧光染料(APC、APC-Cy7等)标记抗体,通常他们会有一个较好信噪比的结果。对于那些不是有较多自发荧光类型的细胞,如新鲜的细胞,可以使用FITC标记的抗体了。Phycoerythrin藻红蛋白,575nm(橙红)异硫氰酸荧光素,525nm(绿)发射光波长peridininchlorophyllprotein多甲藻叶绿素蛋白最大激发波峰490nm,被488nm的氩离子激光激发后,发射光峰值约为677nm,与FITC、PE进行多色荧光染色补偿重叠较少,非特异性结合也较少。虽然较易使用,但量子产量不高,多用于检测表达较高的抗原。allophycocyanin别藻青蛋白,最大吸收峰:650nm,最大发射荧光峰:660nm,适用于双激光流式仪,可被600-640nm波长的激光激发。上海交通大学医学院要保证荧光染料与所研究的细胞参数的结合是特异性的和定量关系的。这样,通过对细胞荧光信号的检测和定量就能了解所研究的细胞参数存在与否与量的多少上海交通大学医学院单激光器FCM至少配置有三个光电倍增管分别接受三种不同波长的荧光信号。并附有荧光补偿电路、或荧光补偿软件来消除荧光光谱相互重叠带来的测量误差。上海交通大学医学院PMTPMTPMTPMT双色滤镜BandpassFilters激光1234流动细胞光电管细胞散色光的波长是与激发光波长一致的.前向散色光信号:检测器采用光电二极管侧向及荧光信号用光电倍增管(PMT)荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管(PMT)检测。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节,因此对弱光测量十分有利。光收集系统:光电倍增管(PMT)上海交通大学医学院信号转换系统:光电数字信号PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.上海交通大学医学院(二)细胞信号的检测与分析制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到激发光的照射.激光与细胞相互作用后可产生散色光信号和荧光信号.上海交通大学医学院(1)细胞散射光信号前向角散射信号(ForwardScatter,FSC):收集的细胞散射光信号的强弱与细胞的大小及活力有关侧向角散射光信号(SideScatter,SSC)又称90度角散射光,对细胞膜、胞质、核膜的折射更敏感,其中特别是胞质的颗粒成分FSCSSC荧光Laser上海交通大学医学院FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter(FSC)细胞散色光信号细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.上海交通大学医学院90DegreeLightScatter(SSC)FALSSensor90LSSensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.上海交通大学医学院FSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关上海交通大学医学院SSCSSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关上海交通大学医学院细胞散色光信号上海交通大学医学院(2)细胞荧光信号主要包括两部分:①自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号,在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。FCM检测分析的细胞荧光信号主要指经过特异荧光染色后细胞受照发射的荧光信号上海交通大学医学院自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号上海交通大学医学院特异染色的荧光信号上海交通大学医学院荧光信号的线性测量对数测量荧光光谱重叠及其校正方法上海交通大学医学院细胞荧光信号AMPAMP经过PMT将光学信号转变为电脉冲信号,并增加PMT的电压及增益,可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种:线性放大(Lin):对数放大(Log):荧光信号的测量:上海交通大学医学院荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长线性测量对数测量细胞荧光信号用于细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量的荧光测量用于细胞膜表面抗原的荧光检测上海交通大学医学院荧光光谱重叠FITC和PE荧光光谱重叠Emissionwavelength(nm)530580630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection两色以上荧光分析存在光谱交叉上海交通大学医学院UncompensatedvsCompensatedFL1FL2利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”荧光补偿上海交通大学医学院荧光补偿方法所有补偿调为“0”调节电压,用同型对照或阴性对照,使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿上海交通大学医学院荧光补偿上海交

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