流式细胞技术与图像处理2011

FLOWCYTOMETRY流式细胞技术流式细胞术以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性或定量分析的技术。流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析台式机FACSAria科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析FACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选第一节流式细胞仪－Introduction鞘液系统光路系统数据系统鞘液系统光路系统光学原理LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统：滤光片光学检测信号数据系统流式细胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPFL4-APC流式细胞的基本信息:“形态”流式细胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合流式常见图形(HistogramPlot)适用于：单参数分析流式常见图形(DotPlot)适用于：多参数分析流式常见图形(Gating)第二节流式细胞术的科研应用分析群体细胞所需时间短多参数分析定性或定量流式应用常见范围细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列等细胞浆内分子：胞内细胞因子等细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学分析继续培养实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭：血清和同型抗体细胞染色染色要求：特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群非特异反应水平低抗体效价高，用量适用于常规标本使用特异的单克隆抗体最好使用荧光直接标记的抗体采用适当的阴性对照物抗体最适滴度抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：适用范围广,biotin-avidin不适合弱抗原的检测实验对照的设计空白对照：ALL阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正，补偿调整管）阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含量。（检测阴性时）流式检测应用实例细胞表面、细胞内分子检测细胞周期分析细胞凋亡分析淋巴细胞表面抗原分析样本来源新鲜抗凝全血PBMC单克隆荧光抗体染色溶血洗细胞固定上机检测淋巴细胞细胞内抗原分析样本来源新鲜抗凝全血PBMC细胞表面抗体染色溶血、固定细胞打孔细胞内抗体染色上机检测IntracellularCytokine-Protocol细胞周期分析：G1MG2SQuiescentcellsG0样品制备1000rpm5分钟收集2X106个细胞PBS漂洗两次70%酒精4度固定过夜收集固定的细胞PBS漂洗PBS悬浮细胞2.5μl10μg/μlRNaseA37℃消化1小时过300目细胞筛50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分钟离心两次混匀，室温静止5分钟上机DNA流式检测的主要指标DNA含量:ploidy：细胞内染色体DNA含量DI：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性SPF：S期细胞占总周期细胞的比例PI：增殖细胞占总周期细胞的比例CV：G0/G1期细胞DNA含量变异系数G1SphaseG2MG1121DNAcontentTheCellCycleDNAcontentbyflowcytometryDeconvolutionintocellcyclephasesG0/1G2/MSEvents细胞凋亡测定：AnnexinVAssay（建议用于悬浮细胞）AnnexinV-PE/PI双染色法双阴：活细胞AnnexinV-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞PI单阳：坏死细胞