流式细胞术原理与应用简介

流式细胞术原理与应用简介湖北中医学院中医药实验中心田代志流式细胞术发展史•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究•1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白•1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利•1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞流式细胞术发展史•1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器•1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计•1972年Herzenberg研制出细胞分选器•1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂•大量厂家不断生产流式细胞仪流式细胞术发展史•目前国内主要流式细胞仪厂家：–BecktonDickinson(BD)公司–BACKMANCOULTER公司流式细胞仪构造•流式细胞仪(FlowCytometer，FCM)的结构分五部分：–流动室及液流驱动系统–激光光源及光束成形系统–光学系统–信号检测与存贮、显示、分析系统–细胞分选及浓缩系统•流式细胞术(FlowCytometry，FCM)图示如下页：流式细胞仪构造模式图流式细胞仪构造示意图流动室与液流驱动系统•流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。•流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。•流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。•鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。•流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统•目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。•激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。•台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。激光光源及光束成形系统光学系统•FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。•主要光学原件：滤光片(Filter)–长通滤片LongPassFilter,LP–短通滤片ShortPassFilter,SP–带通滤片BandPassFilter,BP长通滤片短通滤片带通滤片信号检测与分析•当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。•以激发光光源波长488nm为例示意图：荧光信号示意图散射光信号•散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。–前向散射角(ForwardScatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。–侧向散射角(SideScatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。•散射光信号波长与激光相同。散射光信号示意图RightAngleLightDetectoraCellComplexityForwardLightDetectoraCellSurfaceAreaIncidentLightSource荧光信号•一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。•一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。常用荧光染料•目前台式机FCM配置–488nm激光管常用染料有•PI(PropidiumIodide)•PE(Phycorey-thrin)•FITC(FluoresceinIsothiocyanate)•PerCP(PeridininChlorophyllProtein)•PE-CY5等–633nm激光管常用染料有•APC•APC-CyFCM测量数据的存贮、显示和分析•目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。•数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：–直方图–散点图–等高线图–密度图–三维图直方图•直方图(DistributionHistogram)–横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。–纵坐标一般是细胞数。散点图•散点图(DotPlot)–X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。等高线图和密度图三维图设门分析•可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。FCM的分辨率•分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。•一般要求CV8，最好CV3。FCM图片——台式机FCM图片——大型机FCM的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体FCM的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病FCM的科研应用树突细胞研究干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究FCM的应用——肿瘤学•细胞周期分析•细胞凋亡的分析•凋亡细胞的分析•凋亡相关蛋白的分析•肿瘤相关基因表达的研究•多药耐药基因的研究细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析细胞数量2N4NDNA分析的临床意义•DNA分析诊断肿瘤–DNA非整倍体细胞峰–突出的四倍体细胞峰–SPF15%•DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。•增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)多发性骨髓瘤FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用•DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志•在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息•DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待•形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能•DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标细胞凋亡分析•细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程•细胞凋亡的主要检查手段•形态学检测•Ladders实验•流式细胞术检测•与凋亡相关的病理过程•HIV•自身免疫性疾病•肿瘤细胞凋亡分析•细胞凋亡的主要指标•细胞内酶改变：Caspase-3活化•细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI•细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）•凋亡相关蛋白：•Fas•Bcl-2细胞凋亡—PI分析PI-FluorescenceEvents调亡细胞正常G0/G1期细胞细胞凋亡—ActiveCaspases-3细胞凋亡—Caspases-3细胞凋亡—AnnexinV细胞凋亡—AnnexinV细胞凋亡—BrdUFCM的应用——免疫学•淋巴细胞免疫分型•淋巴细胞亚群分析•CD4绝对计数•HIV的诊断与研究•淋巴细胞CD4/CD8分析•CD4绝对计数•T细胞活化•细胞移植的交叉配型和免疫状态监测FCM的免疫学应用•免疫功能和免疫调控的研究•淋巴细胞和单核细胞的活化•细胞因子的研究•淋巴细胞的增殖•树突状细胞的研究•HLA-B27检测淋巴细胞亚群分析•使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析•各淋巴细胞亚群的百分含量•淋巴细胞亚群的绝对计数临床意义•了解在不同情况下体内免疫功能状态•辅助临床疾病的诊断•探索疾病的发病机理、病程、预后•监测、指导临床治疗方案•免疫系统疾病•免疫缺陷病，AIDS•移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测•肿瘤病人化疗后免疫力检测淋巴细胞亚群分析•根据功能，淋巴细胞主要分为•B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关•T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关•总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病•NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。SimulTESTIMK-Lymphocyte试剂盒•CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰•1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色•CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞•CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞•CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞•CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞淋巴细胞双色分析•LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性淋巴细胞双色分析AIDS病人T细胞亚群分析FCM的应用——血液病学•白血病和淋巴瘤免疫分型•残留白血病•造血干细胞计数•PNH诊断•网织红细胞分析•血小板分析–血小板膜糖蛋白分子的表达–血小板活化–网织血小板分析FCM的应用——分子生物学•分选细胞后进行FISH•分选细胞后进行PCR•流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4＋细胞中HIV特异的DNA或RNA•流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染色体端粒长度性别选择FCM在中医药研究中的应用•我科室开展较多的有如下几个方面的应用：–中药对肿瘤细胞的细胞周期及凋亡影响，抗肿瘤中药成份的筛选–中药对细胞表面（细胞因子、激素）受体表达的影响–中药对细胞粘附分子表达的影响–中药对淋巴细胞亚群（反映免疫状态）的影响–针灸及中药对细胞内酶的表达影响–中药对生精细胞的影响研究–中药治疗艾滋病的研究（我实验室仅提供技术支持）本实验室流式细胞仪及应用介绍•生产厂家：美国BECTONDICKINSON(BD)公司•型号：FACSCalibur•激光器：488nm和633nm各一个•荧光通道（共4通道6参数）–FSC及SSC：480-495nm–FL1：515-545nmFL2：564-606nm–FL3：670nmFL4：653-667nm•技术参数–分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。•常用荧光染料光谱学特征细胞周期分析——PI单染细胞周期分析——PI单染细胞周期分析——ModiFit分析细胞周期分析——ModiFit分析大鼠生精细胞分析——PI单染细胞凋亡—PI加AnnexinV双染FITC-AnnexinVPI淋巴细胞亚群分析CY5.5-CD3FITC-CD4PE-CD8培养细胞表面粘附分子表达培养细胞表面粘附分子表达FCM样品来源•需要制备细胞悬液–血液、体液等液体样品–培养的细胞–活体组织样品–冰冻组织–固定的组织样品直接应用分离后使用样品制备•细胞分离方法–直接离心沉淀–物理方法分离（超声波、筛网等）–酶消化–如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离样品染色步骤•PBS洗细胞1~2次•加（荧光）单抗，暗处孵育15~30分钟•如果必需，加荧光二抗，暗处孵育15~30分钟•PBS洗细胞一次•过300目尼龙网•上机检测PI单染测细胞凋亡步骤•制备细胞悬液•PBS洗细胞1次，1000rpm离心10min，去上清。•加PI染液（含PI50mg/ml,Rnase50ug/ml)，暗处孵育30分钟•过300目尼