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流式细胞术的原理及其应用马洪星FLOWCYTOMETRY流式细胞术FLOWCYTOMETOR流式细胞仪•FlowCytometry–Measuringpropertiesofcellsinflow•FlowSorting–Sorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflow–AlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)分为三大类：第一类－－台式机光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合用于临床第二类－－大型机科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活第三类－－新型流式细胞仪装配有2～4根激光管，同时检测15个参数，高速分选达50000个/s流式细胞仪的主要组成部分：流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。流式细胞仪荧光显微镜控制电脑人脑光源激光紫外光标本制备成的单细胞（或颗粒）悬液放于固定的标本台上效率高几百~几万个细胞/秒低几十个细胞/分结果精确、客观有主观因素功能可同时测多个参数、能进行分选一般只测一个参数、不能分选鞘液系统流动室光路系统检测区光学原理laser抗体标记的方法抗体的选择•首选直接标记抗体•荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原•间接标记适用范围广,biotin-avidin不适合弱抗原的检测数据处理系统流式细胞分析的信息•Forwardscatter(FSC)•Sidescatter(SSC)•FL1-FITC•FL2-PE•FL3-PerCP•PL4-APC流式细胞的基本信息:“形态”流式细胞的主要信息:Fluorescence•FL1•FL2•FL3•FL4最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合Gating常用术语流式常见图形(HistogramPlot)直方图适用于：单参数分析流式常见图形(DotPlot)散点图适用于：多参数分析流式应用常见范围•细胞大小•细胞的颗粒度•细胞表面分子：CD系列•细胞浆内分子：胞内细胞因子•细胞核内分子：P53•细胞功能检测：细胞周期、凋亡•其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）实验对照的设计•空白对照：ALL•阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）•阳性对照：检测阴性时实验标本的处理•单细胞悬液的制备：物理法（剪碎法、网搓法、研磨粉）化学法（酶消化）•抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应•非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭－－血清和同型抗体可用流式细胞仪分析的标本外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、石蜡切片、各种体液（尿、脑脊液、胸腹水等）单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子待测标本处理成单event悬液荧光素标记的单抗染色鞘液经处理的细胞单个通过激光聚焦区检测散射光、荧光信号转化、放大计算机数据处理分选SORTING（细胞分选）分选速度分选纯度分选收获率流式细胞术的应用细胞死亡分两种：凋亡和坏死细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。（一）凋亡的检测•细胞凋亡与坏死的区别虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。细胞凋亡的生物学意义胚胎形成、肌体正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。生物医学的研究热点凋亡检测每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测流式细胞术检测细胞凋亡亚二倍体峰（凋亡峰）---PIstaining不能区分凋亡与死亡细胞AnnexinVAssay建议用于悬浮细胞AnnexinVAssay能够区分死亡与凋亡细胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0（二）定量流式细胞术（quantitativeflowcytomety)通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反映在某种生理病理条件下出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义。微球流式芯片技术CBA(CytometricBeadArray)采用夹心法分析策略,以微珠来捕获可溶性分子。（三）流式细胞术的临床应用•白血病免疫分型•HLA-B27:强直性脊柱炎•淋巴细胞亚群•造血干细胞计数：造血干细胞移植•网织红细胞•PNH诊断（CD55、CD59）•血小板活化试验流式细胞术与造血干细胞移植流式细胞术与白血病免疫分型流式细胞的免疫分型：•是白血病分型的重要指标，而白血病分类是选择化疗方案和判断预后的重要依据。FAB标准(MICM)，形态学、免疫表型染色体、分子生物学结合,•适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。•Minimalresidualdiseases(MRD)微小残留病变的检出（MRD）：MRD是白血病复发的主要根源，FCM的高特异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，早期探测MRD，以免复发。有证据表明外周血淋巴细胞HLA-B27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大相关性，利用流式细胞术进行HLA-B27检测，可同时排除交叉反应，是目前检测HLA-B27的最好方法。流式细胞术与强直性脊柱炎淋巴细胞亚群分析机体免疫状态是衡量机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来检测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T,B,NK淋巴细胞的水平。常用细胞表型及意义（clusterofdifferentiation,CD)CD3总T细胞CD4T辅助/诱导细胞亚群CD8T抑制/细胞毒细胞亚群CD19B细胞抗原CD16+56NK细胞CD33髓细胞前体CD34多能干细胞由于T淋巴细胞在人体的免系统中承担着重要功能，因此当感染发生时，T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反应感染的状态和程度。例如：CD4分子有HIV识别部位，因CD4细胞是HIV病毒的受体，AIDS患者CD4+T细胞明显减少，该指标是诊断AIDS的重要指标。当病毒感染发生时（如乙型肝炎、EB病毒和巨细胞病毒包涵体病毒），CD8+T细胞增多，对CD8T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。利用流式细胞仪可对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、CD25+持续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+T持续下降，表明有感染发生，当其比值小于0.2时必需停用免疫抑制剂。流式细胞术与移植其它免疫性疾病分析SLE患者的淋巴细胞变化可以反应该病的活动情况和器官侵犯程度，活动或非活动性伴有多系统疾病，但无肾脏损害的患者可出现CD4+CD8+T比值升高，伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象。流式细胞术与PNH利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH），根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所连接的蛋白，如DAF（CD55）与MIRI（CD59），来确诊此病，比传统的血清溶血试验具有更高的特异性与敏感性。血小板：巨血小板血小板无力症网织血小板流式细胞术与血小板血栓性疾与血栓前状态：由于活化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高与疾病的发生发展有关。流式细胞术与网织红细胞DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志，FCM在肿瘤学上的应用，主要是利用DNA含量测定，进行癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作。癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致，而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系。流式细胞术与肿瘤FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌前病变的早期诊断。DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的诊断，如卵巢交界性肿瘤，异倍体的出现与病变的恶性发展有关。DNA异倍体、高S期细胞比值和高增殖细胞核抗原（PCNA）表达与细胞增殖能力、恶性程度和不良预后呈正相关。为治疗方案和药理学研究提供依据：不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式。流式细胞术与生殖医学正常男性精液中均为单倍体细胞，而由于精子发生障碍所致不育的男性精液中会出现大量2倍体和4倍体细胞。1、精子的有无2、精子形成过程中那一步发生阻滞流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，分拣纯化染色体，定位基因，构建文库等。（四）流式细胞术在植物研究领域的应用遗传HEREDITAS(Beijing)27(3):461~465,2005流式细胞术分析和分拣植物染色体流式细胞术在富营养淡水湖泊微型浮游植物细胞中的应用细胞生物学杂志2004，4，26卷第2期（五）流式细胞术在环保领域的应用粉尘粒子随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。