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流式细胞术---原理、操作及应用生物化学与分子细胞生物学系流式实验室地址：西7楼107室电话：63846590-776423教学参考书•实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4•临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8•流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.2•实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学出版社。2010.9•流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10主要内容•一、流式细胞仪结构和原理–流式细胞术简介–流式细胞仪的结构组成–流式细胞仪的光信号检测–流式细胞术数据的存贮、显示与分析–流式分选•二、流式细胞术操作与技巧•三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1流式细胞术简介•流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。•流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点•检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；•检测参数：多参数；•检测特点：单细胞水平分析；•检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；•检测结果：精度高、准确性好；•可对目标细胞进行分选；•流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；•WB：群体分析，得到多个细胞的平均值。流式细胞仪的发展及商品化•1934Moldavanl:Firsttry(固定式细胞分析-流动式)；•1953Crosland-Taylor:鞘流系统(解决难题)；•1956Coulter原理(血细胞计数器)；•1965Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；•1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；•1969Vandilla等:第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)；•1972斯坦福大学:研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；•1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACSⅠ。•1975Kohler和Milstein:单克隆抗体技术(促进流式发展)。1979年国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪；1982年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收；1985年获国家卫生部科技成果乙等奖；1985年--1990年灵敏度、信噪比、更多参数；流式分选仪研制开发；计算机四参数软件；样品制备、医学生物学应用。流式细胞仪的分类•分析型流式细胞仪–细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。•分选型流式细胞仪–既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；–进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。BD公司分析型流式细胞仪FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII双激光六色，三激光八色FACSVerse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBeckmanCoulter流式细胞仪EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型1.2流式细胞仪的结构组成•液流系统–流动室–液流驱动系统•光学系统–激发光源–光束收集系统•电子系统–光电转换器–数据处理系统•细胞分选系统–喷嘴–电偏转板–样本收集器1.2.1液流系统•鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。•流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图（一）流动室和液流驱动系统•流动室(flowcell,flowchamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器液流驱动系统（二）进样速率控制10psi10.2psi10psi10.8psi•通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。•高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。1.2.2光学系统（一）激发光源：激光器•气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；•染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光；•半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACSCalibur已采用635nm半导体激光器。–激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。–现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、633nm和355nm、405nmUV；（二）光束成行系统FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。细胞流动方向（三）光收集系统•滤光片的组成–长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；–短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；–带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。LongpassShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统•透射光路•全反射光路FACSAria流式细胞仪器信号检测系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.2.3电子系统•光电检测器将光信号转换成电子信号。•前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。•模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。•数据处理系统计算机系统数据采集、分析。（一）光电检测器(photodetector)•光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；•光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光电二极管（二）电信号两种放大方式•由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)•一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度WCreationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0QuantificationofaVoltagePulseWidth=Area/Height光信号电信号数字信号•通道(channel)一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：–散射光通道:FSC通道和SSC通道；–荧光通道•通道命名方式：–以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。–以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。•Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。1.3流式细胞术光信号检测光信号的类型•散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。–前向散射光(forwardscatter,FSC);–侧向散射光(sidescatter,SSC).•荧光信号–自发荧光：微弱–特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。1.3.1散射光信号（一）前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。（二）侧向散射光SSC•SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）散射光的作用•实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片死细胞或碎片粘连细胞肿瘤细胞株FSC/SSC散点图死细胞加药处理后FSC/SSC散点图•通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。（三）阈值Threshold•阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。•FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后1.3.2荧光信号（一）荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长(荧光波长)Emissionwavelength激发波长Excitationwavelength＜（二）常用荧光素499nm蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素荧光素分子激发光波长（nm）发射光波长（nm）中文名FITC490520异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白-花青素7AlexaFlour488495519AlexaFlour647650665核酸荧光染料•PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。•7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。•DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。•Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。•PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。•AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。其他常用荧光染料测量参数荧光染料激发波长(nm)荧光波长(nm)报告基因GFP475509YFP514527细胞示踪染料CFSE495519FAM488525细胞膜电位DiO-C6485505Rhodamine123511546细胞内pH值SNARF-1514587/640细胞内钙浓度Fluo3506528Indo-1(low）361485Indo-1(high）330405氧自由基DCFHDA505535（三）荧光抗体的选择A根据流式细胞仪选择抗体•流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定)。如FACSCalibur：•多色标记