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2.5生物学指标的测定细菌总数的测定•指1ml水（或1g样品），在普通琼脂培养基中经37℃、24h培养后所生长的细菌菌群总数。•评定水体污染程度指标之一。•生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）规定每毫升水的细菌总数不得超过100个。•水中通常存在的细菌大致可分为三类：•①天然水中存在的细菌。普通的是荧光假单孢杆菌、绿脓杆菌，一般认为这类细菌对健康人体是非致病的。荧光假单胞杆菌细菌分类•②肠道细菌。它们生存在温血动物的肠道中，故粪便中大量存在。水体中发现这类细菌，可以认为已受到粪便的污染。致病性肠道细菌有沙门氏杆菌（伤寒和副伤寒菌）、B型炭疽菌、痢疾志贺氏菌和霍乱弧菌等。•③土壤细菌。当洪水时期或大雨后地表水中较多。它们在水中生存的时间不长，在水处理过程中容易被去除。腐蚀水管的铁细菌和硫细菌也属此类。大肠杆菌铁细菌平板计数法•国标规定的方法为平板计数法•检验方法：在玻璃平皿内，接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中，冷却凝固后在37°C培养24小时，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数。•精度高，耗时长。为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法、SimplateTM全平器计数法、微菌落技术、纸片法等检测方法。平板计数法总大肠菌群的测定•总大肠菌群：需氧及兼性厌氧的在35℃、48h之内生长时能使乳糖发酵、产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌，以每升水样中所含有的大肠菌群的数目表示。总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。•包括:大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌•生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）规定每100mL水不得检出总大肠菌群。革兰氏染色法•细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。•革兰氏染色属复染法。•革兰氏染色法能够把细菌分为两大类，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。•染色的差异主要由阴性与阳性细菌细胞壁的差异引起。革兰氏染色法•先用龙胆紫（亦称结晶紫）来染细菌，所有细菌都染成了紫色•涂以革兰氏碘液，来加强染料与菌体的结合•用95%的酒精来脱色20～30秒钟，有些细菌不被脱色，仍保留紫色，有些细菌被脱色变成无色•用番红或沙黄复染1分钟，结果已被脱色的细菌被染成红色，未脱色的细菌仍然保持紫色，不再着色•凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌（G+菌）；染成红色的称为革兰氏阴性菌（G-菌）。•常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；•常见的革兰氏阴性菌：痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等。多管发酵法配制培养基•在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。初步发酵试验•水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。多管发酵法复发酵试验•微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。多管发酵法结果计算滤膜法•滤膜是一种微孔性薄膜。•将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45μm）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，37℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有大肠菌群数。滤膜法•将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。也可用121℃灭菌10min，10min一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。•以无菌操作把滤器装置装好。•过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。•将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。滤膜法•由滤膜上生长的大肠菌群菌落综述和所取过滤水样量，按下式计算1L水中总大肠菌群数：其他细菌的测定•生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）规定每100mL水不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。•粪大肠菌群•多管发酵法或滤膜法，培养温度44.5℃•沙门氏菌属•滤膜法浓缩水样-培养和平板分离-生物化学和血清学鉴定•链球菌•进入水体后，在水中不再自行繁殖。•根据大肠菌群与链球菌菌数的比值不同，可以推测粪便污染的来源