肺癌个体化检测及质控

肺癌个体化检测及质量控制Female2761casesmale6584cases29.5%70.5%1:2.383%9.8%31.1%49.5%6.5%2004WHOLungCancerClassification腺癌大细胞癌鳞癌腺鳞癌其它腺癌8140/3腺癌，混合性亚型8255/3腺泡性腺癌8550/3乳头状腺癌8260/3细支气管肺泡癌8250/3非黏液性8252/3黏液性8253/3非黏液和黏液混合性8254/3实性腺癌伴有黏液产物8230/3胎儿性腺癌8333/3黏液性（“胶样”）癌8480/3黏液性囊腺癌8470/3印戒细胞腺癌8490/3透明细胞腺癌8310/3肺癌的WHO组织学分类（2004年）浸润前病变非典型腺瘤性增生原位腺癌（≤3cm原来的BAC）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性微浸润性腺癌（≤3cm贴壁状为主的肿瘤，浸润灶≤5mm）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性浸润性腺癌贴壁状为主（原来的非黏液性BAC生长方式，浸润灶＞5mm）腺泡性为主乳头状为主微乳头状为主实性为主伴有黏液产物浸润性腺癌变型:浸润性黏液腺癌（原来的黏液性BAC）胶样型胎儿型（低度和高度恶性）肠型肺腺癌的IASLC/ATS/ERS分（2011年）小活检和/或细胞学标本难以进一步分型，通常诊断为非特指性NSCLC（NSCLC-NOS）提出借助于免疫组织化学（TTF-1、p63(p40)等）尽可能将NSCLC区分为倾向腺癌和倾向鳞状细胞癌，以提供药物治疗的选择肺腺癌对多靶点抗叶酸药物培美曲赛（pemetrexed）和抗血管内皮生成药物贝伐单抗（bevacizumab）治疗有效，而鳞状细胞癌对培美曲赛治疗效果不如腺癌，用贝伐单抗治疗可引起威胁生命的大出血小活检和细胞学诊断肺癌TTF-1鳞癌?腺癌?鳞癌?腺癌?P63(p40)小活检和细胞学标本除用于病理诊断外，要适当留存一些标本做分子检测（基因突变、扩增和染色体易位等）新分类还推荐如有可能，细胞学检查最好与小活检细胞学检测一起进行，以提高诊断准确性细胞学是一个有用的诊断方法，尤其是和组织学相结合时从细胞穿刺或胸腹水标本中保存细胞包埋块（cellblock)，用于分子检测小活检和细胞学诊断肺癌2011年NCCN非小细胞肺癌治疗指南（中文版）2012NCCN指南推荐所有NSCLC患者进行检测中国版NCCN指南与美国版NCCN指南的区别：除了腺癌、大细胞癌和未分类的NSCLC患者，中国版NCCN指南要求鳞癌也要进行EGFR突变检测2013NCCN指南推荐更新，EGFR检测更为重要2013NCCN指南与既往不同在于：未知人群减少，腺癌/大细胞癌患者均需要做检测为I类证据/不吸烟鳞癌也可以EGFR突变检测卫生部原发性肺癌诊疗规范（2011）NatureReview2007,7:169非小细胞肺癌中药敏相关的EGFR突变外显子19，21突变为常见EGFR敏感突变类型DacicS.AdvAnatPathol2008;15:241-247.RielyGJ,etal.ClinCancerRes2006;12(24):7232-7241.MurrayS,etal.JThoracOncol2008;3:832-839.对EGFR-TKI的反应外显子突变分布频率敏感18G719X4%19缺失50%21L858RL861X40%耐药20T790MD770_N771insNPG6%肺癌与EGFR目前国内开展EGFR检测的单位逐渐增多有关中国人EGFR基因突变研究的报道增多2011年中华病理学杂志发表了“关于EGFR突变检测共识”2011年11月15日1成立卫生部分子病理质控中心项目孙孟红王芳冯勤王立帅赵静范苗静张杰合计技术测序TagManPCR优化PCRARMS测序测序测序总数目29914103092651922824543211突变率42.2%28.4%34%30.2%33.3%42.6%48.2%37%吸烟与突变非吸烟／37.6%40.2%41%50%54.3%52.7%46%吸烟／14.4%22.2%15.2%9%32.9%41.1%22.5%性别男33.7%19.8%30.4%22.6%20.9%36%39.5%29%女53.5%43.2%39.2%39.7%51.9%51.3%59.6%48.3%(中华病理学杂志2011年10期）项目孙孟红王芳冯勤王立帅赵静范苗静张杰合计外显子分布182%／5.7%／／4.1%3.9%1948.7%48.1%39%40%60.9%48.4%53.9%48.4%206.7%／／6%／6.43%6.4%2142.5%51.8%55.2%54%39.1%51.6%44.3%48.2%组织分型腺癌46.5%33.5%38.8%37.8%37.9%47.8%56.8%42.7%BAC／61.3%／58.5%73%47.1%普通／32.4%／37.9%／／鳞癌13.3%／22.2%／7.5%23.6%10.3%15.4%腺鳞癌7／13／4／8／2／67／910／18大细胞癌／／3／14／1／5／10／31其他／／／／5／／(中华病理学杂志2011年10期）EML4-ALK检测：方法概述荧光原位杂交(FISH)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)Ⅰ期临床结果再回顾三种检测方法比较FISH、IHC和RT-PCR比较参数表FISHIHCRT-PCR灵敏度分离信号细微使用检测增强装置后灵敏度可提高高检测到未知的变异体是是否可否区分融合类型否否是工作强度大是否否要求非常专业的培训是否否结果判读人为主观影响大大小同时细胞形态可视化否是否在专业机构外广泛使用否是否AdaptedfromMitsudomi,IASLC2011;Abs#MTE22.1Hirsch,IASLC2011;Abs#O05.08ROS1基因与NSCLCROS1基因位于6号染色体长臂22（6q22）共有43外显子其mRNA全长7638bpROS受体酪氨酸激酶的靶向治疗原理FN-IIIlikerepeatsTKdomain●ROS在脑、肺、胃、乳腺和肝肿瘤/细胞系中的过表达●在结肠癌和肾癌细胞系中ROS突变●肿瘤中发现的ROS融合–FIG-ROS：恶性胶质瘤细胞系–SCL34A2-ROS:非小细胞肺癌细胞系–CD74-ROS:非小细胞肺癌患者●克唑替尼可抑制ROS融合基因细胞系的生长StructureofROSEl-Deebetal.,MedResRev.2010epub克唑替尼:概述●名称:PF-02341066●通用名:克唑替尼●商品名:XALKORITM●化学式:C21H22Cl2FN5O●作用机制:竞争性ATP抑制剂●主要靶点:ALK、c-Met、ROS●2011年8月26日美国FDA批准用于ALK阳性非小细胞肺癌克唑替尼在ALKATP结合部位Pfizer,dataonfileROS1基因重排ROS1的重排成为了一种继成功发现肺癌突变基因KRAS（占25%）、EGFR（占10-15%）、ALK（占4%）后，再一次发现最新的肺癌基因突变ROS1。ROS1基因突变的癌症患者常见于年龄偏小，不吸烟，病理类型为腺癌的肺癌。由ROS1基因重新排列引起的癌症在非小细胞肺癌中占1%。ROS1重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表达及对ROS激酶抑制剂敏感性。Crizotinib作为C-MET、ALK及ROS的小分子酪氨酸激酶抑制剂可能成为进展期非小细胞肺癌有效治疗药物。该药物已经获准用于局部进展期和转移性ALK阳性的非小细胞肺癌患者的治疗。分子靶向基因检测质量问题实验室：达标人员资质标准化检测人员上岗培训、上岗证书报告签发人员资质、分子病理医师实验条件；检测方法：方法越是灵敏，抗污染的问题越是突出标本来源：不同的标本，应相对采用不同的检测方法分子病理实验室质量要求二.PCR实验室要达标，通过国家验证检测结果要做室间比对国际间的室间比对(EMQN,ESP,ETOPandESMO)分子病理实验室要通过ISO15189认可临床标本与研究标本的差异标本类型肿瘤细胞含量标本处理其他分析前、分析后处理实际临床标本新鲜组织、蜡块、穿刺组织、脱落细胞等随意性大，无严格要求固定方式、试剂、标本离体时间各异不定研究标本统一要求要求统一，被病理所确认统一的保存以及运送条件尽量统一分子检测与靶向治疗的关键步骤根据结果制定治疗方案临床采集合适的组织标本选择合适的检测方法123分子检测与靶向治疗的关键步骤根据结果制定治疗方案临床采集合适的组织标本选择合适的检测方法123标本来源手术切除标本气管镜活检标本经皮穿刺标本淋巴结穿刺标本胸水/心包细胞学标本血清DNA标本及循环细胞标本相关问题标本异质性标本类型标本的收集和储存标本是获得高质量检测结果的重要前提常用标本获取方法CT引导下肺穿刺活检模拟气管镜引导下经支气管镜肺组织活检(VB-TBLB)经气管镜超声引导下活检(EBUS)锁骨上淋巴结穿刺活检胸腔闭式引流术心包穿刺术外科开胸手术活检胸腔镜活检纵隔镜活检微创手术活检取样中存在的问题肿瘤的位置肿瘤生长的部位有时难以进行内科穿刺活检，需要依靠外科手术活检取材细针穿刺时使用的器材尺寸可能影响细胞的获取量及DNA的质量由于无法保证每次都能取得足够的标本，需要一些适用于小标本的检测方法肿瘤标本获取的主要途径手术(切除/切取)支气管镜(活检：中央型)穿刺(活检：周围型)制备蜡块切片HE染色确认癌细胞以临床医生认为最容易获取的方式原发病灶/转移灶肿瘤组织胸水等标本的获取标本的获取：以穿刺为例可行性评估根据病灶位置选择合适的穿刺手段复杂情况的处理严重水肿基底部位呼吸动度较大部位的肿块肿块内部支气管充气征明显肿瘤内血管丰富基底部位呼吸动度较大部位的肿块肿瘤内血管丰富严重水肿肿块内部支气管充气征明显标本的获取对周围型病变，TBLB创伤小，可重复性强，是一种相对安全有效的检查方法，但TBLB取材大小受器械规格限制，活检组织易受挤压变形而影响检测结果1锁骨上淋巴结穿刺活检是一种便捷有效的临床技术，检出率高，副反应小2，但仅能提供细胞学样本。EBUS可通过中央气道取的组织，诊断迅速，并发症少，是一种安全性较好的活检方法。对肺癌和其他纵膈恶性疾病诊断价值高，并可协助分期3胸腔闭式引流术和心包穿刺术并发症少，容易为患者接受，术前需行超声定位，可在超声引导或CT引导下进行4,5。但引流获得标本需进一步富集。外科方法可获取大量、新鲜样本，但创伤较大或费用昂贵经支气管肺活检肿瘤正常细胞的5%CT引导穿刺肺癌的活检标本通常仅含有少量肿瘤细胞适宜的切片：•HE片确认*，癌细胞数≥200个(不推荐依经验盲取)•常规切片(4~5μm厚，普通载玻片)•连续切片8~10张•刀片：一次性(不推荐交叉使用)标本处理：•离体后处理：及时切开、固定(尽快)•固定液：10%中性福尔马林(pH≈7.0)(不推荐使用任何其它溶液)•固定液量：≥10倍体积•固定时间：6~48小时如何获取优质标本：标本处理如何获取优质的标本：标本类型石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好(50%以上)；组织部位面积约6mmx6mm以上包埋组织：组织块不小于0.5×0.5×0.5(cm)新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更有利，但一定要经病理学确认含有肿瘤组织50%以上；重量≥10ｍg(约米粒大小以上)，经PBS或生理盐水冲洗干净取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域)，固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科要有病理学诊断只要能获得足够的癌细胞，各种取材方式均可对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的信息如何获取优质的标本：标本类型尽可能取得大标本进行检测临床常用的取样方法取得标本量通常较少内镜活检、穿刺活检、细胞学标本(支气管刷检,细针穿刺)小标本检测失败率53–66%(内镜