基因表达调控-1

基因表达与调控基因组(Genome)：一个细胞或生物体所携带的一整套基因；基因表达:基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列生化反应过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程；基因表达受体内外各种因素的影响，具有时空特异性。基因表达的调节在多个水平上进行•转录前水平的调控:组蛋白修饰等•转录水平调控:转录酶、启动子、顺式元件、反式因子•转录后水平的调控：mRNA剪接mRNA编辑mRNA稳定•翻译水平的调控：蛋白质合成速度的控制•翻译后水平的调控蛋白质修饰蛋白质稳定蛋白质的靶向运输基因表达的诱导和阻遏诱导表达（inducedexpression）：在特定环境信号刺激下，使基因开放或表达增强的调节方式阻遏表达（repressedexpression）：在特定环境信号刺激下，使基因关闭或表达下降的调节方式顺式作用和反式作用顺式作用元件：在基因旁侧序列中或基因内部，可影响基因表达的特定DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子，绝缘子等；与顺式元件相关的基因表达调节称作顺式作用；反式作用因子：可直接和间接与顺式作用元件结合的调节蛋白，可调节基因的转录。与反式调节因子相关的基因表达调节称作反式作用。转录水平的调控㈠顺式作用元件：包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）和沉默子（silencer），绝缘子（insulator）等。1．启动子：转录起始位点前，RNA聚合酶结合处，含有多个调控元件包括至少一个转录起始位点以及一个以上的功能元件Initiator(Inr):位于转录起始位点处，保守序列为YYCAYYYYYTATAbox：位于-25至-35的区域，保守序列为TATAAAATFIID结合位点CAATbox：位于-70至-80的区域，保守序列为CCAAT序列NF1结合位点GCbox:位于-80至-110的区域，保守序列为GCCACACCC或GGGCGGGSP1结合位点混合碱基代码：Y=C/T;R=A/G;M=A/C;W=A/T;K=G/T;S=G/C真核细胞含有三种不同的RNApolymerase，分别用于不同基因的转录：·RNApolymeraseI：转录rRNA·RNApolymeraseII：转录mRNA·RNApolymeraseIII：转录tRNA和其它小RNAs.每种RNAPolymerase结合的启动子性质有所不同。启动子模式图TATA-less启动子•不含TATABox的启动子称TATA-less启动子（占50%）•TATA-less启动子通常在转录起始位点的下游含一个下游启动子元件R-G-W-C-G-T-G(downstreampromoterelement，DPE)，位于+30处.•核心启动子要么由TATAbox+InR要么由InR+DPE构成.2．增强子增强子是远离转录起始位点（1-30kb）、通过启动子来增强基因表达的调控元件增强子有以下特点：①可提高同一DNA链上靶基因的转录效率；②对细胞和组织有很强的特异性。但对所作用的基因无专一性，提示增强子的作用需要组织专一性的转录因子；③增强子的效应与其位置和方向无关。增强子可在基因的5′上游，基因内或3′下游序列中；3.绝缘子能阻止附近的调控元件对基因转录的活化或抑制。绝缘子发挥作用的模式图4．沉默子（silencer）在DNA中，有些调控序列对转录有抑制作用，当这些位点被阻遏物占据，可使其附近的启动子失活，基因便不能表达，这种调控序列就称为沉默子。㈡反式作用因子又称转录因子，能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件8-12bp核心序列上，参与调控靶基因表达效率的蛋白质。按其功能特性将转录因子分为三类：1．基本转录因子：与RNAPolymerase一道组成转录起始复合物2．转录激活/抑制因子：直接与DNA元件结合并发挥调节作用3．辅助调节因子：不直接与DNA元件结合，但通过蛋白-蛋白相互作用，在转录起始复合物与转录激活/抑制因子间搭建联系的桥梁。-转录因子至少包括两个不同的功能结构域：DNA结合和转录调节⑴DNA结合结构域主要包括以下几种类型①螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix，H-T-H）：蛋白质分子中的两个α螺旋通过一段短肽形成的“转折”连接。②锌指（zincfinger）结构：由氨基端的2个反向平行的β-折叠和羧基端1个α-螺旋组成。在锌指结构的N-端有两个相近的半胱氨酸，在C-端有一对相邻的组氨酸，它们在空间上形成一个能容纳Zn2+的洞穴，而且洞穴内的Zn2+能与这4个氨基酸残基配位连接而形成手指样的形状。③亮氨酸拉链（leucinezipper，ZIP）每个单体构成半个拉链，它具有形成α-螺旋的特点，其中每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸或疏水氨基酸，导致第7个亮氨酸或疏水氨基酸残基都在α-螺旋的同一侧出现，它是部分转录因子二聚体生成的结构基础。④碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）结构bH-L-H结构由两个双性的α-螺旋和夹在其中的由氨基酸残基组成的环形成，靠近第一个α-螺旋的氨基端有一个碱性区，可与DNA的大沟结合。⑵转录活化结构域：以下的结构为不同的转录活化结构域①带负电荷的α-螺旋结构域②富含谷氨酰胺的结构域③富含脯氨酸的结构域④不规则的含有双性α-螺旋和酸性氨基酸的结构域转录水平的调控转录起始复合物的生成RNApolymerase：所有真核RNApolymerases含有约10多个亚单位，分子量500kD.TFIID：与TATABox结合的转录因子复合物，亚单位含：TBP(TATAbindingprotein);TAFs（与TBP结合的因子）.TFIID中所含的TAF种类和数量可有不同，含不同TAF的TFIID识别不同的基因启动子。TAFII230是TBP与TATA结合的抑制性亚单位。TFIIA：释放TAFII230，增加TBP的TATA结合能力；TFIIB：结合在TATABox的下游区域，协助RNAPolII定位；TFIIF：含两个亚基，大亚基为解螺旋酶，小亚基参与RNAPolII定位；TFIIE:DNA解链，促RNAPolII移动；TFIIH：解旋酶、ATPase、Kinase，促RNAPolII脱离启动子，进入RNA合成的延伸过程TFIIJ：协助TFIIH工作。转录后的调控未被剪接的RNA初始转录物，因长度很不均一，因此被称为异质性核内RNA（heterogeneousnuclearRNA）㈠初级转录本的加工1．初级转录本的剪接、5′加帽、3′加尾2．RNA的编辑（RNAediting）RNA编辑是RNA分子的一种修饰现象，DNA在转录成hnRNA后，因插入、删除或碱基替换而改变了DNA模板原来的遗传信息mRNA的编辑(mRNAediting)人类apoB基因mRNA（14500个核苷酸）肝脏apoB100（分子量为500000）肠道细胞apoB48（分子量为240000）mRNA编辑C2153-U2153CAA-UAA研究基因转录调控的方法1.Reportergeneassay2.EMSA(Electrophoreticmobilityshiftassay)3.Foot-pringting4.Methylationassay5.Tet/offandTet/onassay6.NorthernBlotting7.ChIP8.SAGE9.Westernblottingassay10.PCRassayReporterGeneAssayTechniqueForpromoter,enhancer,silencerandtranscriptoractivityReportergenesusedinreportergeneassay:1)Luciferase,LucATP+luciferin+O2AMP+oxyluciferin+PPi+light2)b-galactosidase,b-GalX-gal5-bromo-4-chloro-indigo3)Chloramphenicolacetyltransferase,CATChloramphenicol+C14-acetyl-CoAC14-acetyl-Chloramphenicol+CoA4)Greenfluorescentprotein,GFPFrombioluminescentjellyfishAequoreavictoriaDiscoveredbyShivomuraat1962238Aa,11b-sheets,Ser-65/Tyr-66/Gly-67用于报告基因分析的质粒载体Howtousereporterassayinyourexperiments:1.todeterminetranscriptionalactivityofpromoter2.toidentifypromoterandcis-elements3.toasaayinterractionbetweencis-elementandtrans-factor4.tostudyenhancerandsilencer5.tostudyeffectsofenvironmentalchangesongenetrancription6.tostudyeffectsofpromotermutationongeneexpressionReporterAssayFoot-printingassayToidentifyDNAbindingproteininCiselements12341.制备待标记的DNA片段2.将DNA片段进行末端标记（仅在一端）3.将待测定蛋白质与标记DNA混合反应4.用低活性DNaseI部分消化DNA5.将消化后的DNA进行测序胶电泳6.X光片显影7.分析结果Electrophoreticmobilityshiftassay（EMSA）--MethodforIdentifyingDNA-ProteinComplexSuper-shiftassay