基因表达载体的构建

第六章外源基因在大肠杆菌中的表达调控•第一节基因表达的概述和基本条件•第二节在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素第一节基因表达的概述和基本条件•一、基因表达的基本概念•二、基因表达的基本条件•三、真核基因在原核细胞中表达及调控第二节在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素•一、启动子结构对表达效率的影响•二、表达载体的选择•三、外源基因（cDNA）中密码子的作用•四、mRNA的一级结构与基因表达•五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响•六、mRNA稳定性的影响•七、转录终止区对外源基因表达效率的影响•八、转录后的若干因素与基因表达的关系•九、宿主选择对表达的影响•十、培养条件的控制对表达效率的影响一、基因表达的基本概念生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上,基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。二、基因表达的基本条件•1.外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。•2.插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。•3.外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。三、真核基因在原核细胞中表达及调控•真核基因在原核细胞中表达及调控的特点•㈠有效转录及其调控元件•㈡正确转译•㈢原核表达载体的构建㈠有效转录及其调控元件•1.RNA聚合酶•2.启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类）•3.转录作用的终止•4.转录的弱化作用㈡正确转译•1.起始密码子（intiqtioncodon,initiator）•2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）㈢原核表达载体的构建•原核表达载体的构建的要求•1.表达载体类型•2.表达载体的举例•3.包涵体表达载体启动子•⑴乳糖启动子（Lac）•⑵Trp启动子•⑶Tac启动子•⑷噬菌体的PL和PR启动子•⑸脂蛋白启动子（LPP）启动子结构对表达效率的影响•启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。表达载体的选择•载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。外源基因（cDNA）中密码子的作用•细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低mRNA的一级结构与基因表达1.启始密码子：表达效率AUGGUGUUG2.SD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有增强作用。mRNA的二级结构对翻译起始的影响•mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1mRNA稳定性的影响•REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子也起保护作用。真核基因在原核细胞中表达及调控的特点1.只有一种RNA聚合酶2.以操纵子为单位来完成基因转录3.基因转录无RNA剪接功能4.因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的5.转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链6.有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始7.无糖基化功能RNA聚合酶•原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上的启动子进行转录。启动子的概念•启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。转录作用的终止•由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。•强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10•弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用。如图6-11转录的弱化作用•转录的弱化作用使转录没有到达终止信号处而中途停止转录，使mRNA转录发生部分停止，而不是发生全部停止。起始密码子•起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUG＞GUG。核糖体结合位点•转录mRNA的AUG上游具有的，能与核糖体发生有效结合和转译所需要的序列（RBS），长度为3-9bp，距AUG3-11bp，它与16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互补其互补程度、SD与AUG间距等与转译效果有关。如图表达载体类型•表达载体的类型主要有四种：1.非融合型表达载体，如PKK223-3如图6-142.分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1如图6-153.融合蛋白型表达载体，如PGEX如图6-164.包涵体型表达载体，如pBV220如图6-17原核表达载体的构建的要求•完整的表达载体（质粒）应有强启动子（P）、终止子（T）、多个酶切位点、有抗性标记、复制子和RBS的SD序列。（如图6-13）还应结合考虑：质粒的拷贝能力和稳定性，转译蛋白的表达形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质的分子量、性质和稳定性以及选择合适宿主细胞。乳糖启动子（Lac）•无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2•而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）诱导转录。Lac启动子改建如图6-3、6-4(a)(b)Trp启动子•色氨酸启动子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的竞争性抑制剂，常用作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。（如图6-5）同时，衰减子对Trp转录也有调节作用（如图6-6）Tac启动子•Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该启动子只需用IPTG诱导转录即可。如图6-7噬菌体的PL和PR启动子•PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR转录，但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。脂蛋白启动子（LPP）•脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高，该启动子表达效率高，由信号肽可将基因表达产物分泌到胞外，常用来构造分泌型表达载体。起始密码子的结构特征基因位于单链区域位于碱基配对区域蛋白产量的相对浓度D是否876K是否476U是否375V是否265MU3是否236A否是1C否是18H是否12L否是44M否是14J是否13