血流感染实验室诊断

血流感染实验室诊断新进展北京协和医院检验科王瑶2013年4月13日内容•什么是血流感染？•血流感染流行病学特点•血培养流程优化–提高阳性率–分析培养结果–减少污染•分子生物学方法检测血流感染–基于PCR的技术–MALDI-TOFMS–PNA-FISH概念•感染＝炎症+病原体•全身炎症反应综合征（SIRS）–体温38⁰C或36⁰C–心率90次/分–呼吸频率20次/分，或PaCO232mmHg–白细胞12×109/L或4×109/L，或幼稚细胞10%•脓毒血症（sepsis）＝感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性•重度脓毒血症（severesepsis）＝sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压•感染性休克（septicshock）概念•败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。•菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。•血流感染（bloodstreaminfection,BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。血流感染•医院获得性血流感染–原发血流感染•实验室证实血流感染（Laboratory-confirmedBloodstreamInfection,LCBI）•临床血流感染（ClinicalSepsis）–继发血流感染：血培养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。•社区获得性血流感染实验室证实血流感染（LCBI）•标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。•标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（38⁰C），寒颤或低血压，并致病符合下列之一：–1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。–2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。–3.血中抗原检测阳性（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。•标准三：年龄1岁的病人具备下列症状或体征中的至少一项，发热（38⁰C），低温（37⁰C），呼吸暂停、脉搏徐缓，并具有下列之一（同上3点略）临床血流感染（ClinicalSepsis）具有下列二条件之一者：•具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压≤90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者：–未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者–其它部位无明显感染者–医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗•1岁以下婴儿，具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者：–未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者–其它部位无明显感染者–医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗BSI流行病学特点•BSI发病率逐年增加•凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升，革兰阴性菌下降•耐药菌比例逐年增加•社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异•院内BSI患者病死率高美国脓毒血症流行病学+600%+300%+300%Martinetal,NEJM2003;348:1546加拿大CANWORD监测2002-2009DiagMicrobioloInfectDis.2011;69:307加拿大CANWORD监测2002-2009DiagMicrobioloInfectDis.2011;69:307美国49医院BSI病原谱CID.2004,39:309-317PUMCH2012年834血培养分离株PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果ESBL60.2%PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果ESBL34.4%PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果2011CHIF-NET489株BSI酵母菌2011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性2011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的敏感性2011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性2011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的敏感性采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素•CLSIM47-A：每位患者采集2~3套血培养（40~60ml）•SurvivingSepsisCampaignGuidelines(Worldwide)：抗菌药物治疗前至少采集2套血培养•英国NHS血培养标准：采集2套血培养采血量对血培养阳性率的影响010203040506070809010012*3*4BloodCultureSetJCM2007采血量对血培养阳性率的影响J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047RoutineSet@MayoClinic:2BACTECAerobicPlusBottles+1BACTECAnaerobicLyticBottle采血量和阳性率27非条件致病菌28•在多次血培养中单次培养下列细菌阳性•凝固酶阴性葡萄球菌•棒状杆菌•微球菌•丙酸杆菌•芽孢杆菌•如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析血培养污染菌非条件致病菌MayoClinic(p0.001)为什么需氧+厌氧？29PathogenNo.两种组合均能检测不同的病原菌J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047表皮葡萄球菌血培养阳性意义CID1997#ofsetsPositive#ofsetsObtained%Significant%Contam%Indeterm1109731229532260337130100023750253310000血培养阳性时间－凝固酶阴性葡萄球菌96%(+)86%单瓶（＋）需氧瓶＝242厌氧瓶＝72需＋厌＝150血培养阳性时间－金黄色葡萄球菌如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌？•UniversityHospitalofBase，2003－2007•3060阳性血培养，654CNS，粒缺患者除外•232(35%)真正BSI，422(65%)污染•BSI由感染科医生判断，至少一份血培养CNS阳性，有感染临床表现•SIRS:体温38Cor36C;心率90/min;呼吸20/min;白细胞12or4G/Lor10%未成熟中性粒细胞•32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68%，污染12%(p0.001)•没有SIRS症状：BSI5%，污染29%(p0.001)ClinMicrobiolInfect.2012online单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别ClinMicrobiolInfect.2012online单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性ClinMicrobiolInfect.2012onlineClinMicrobiolInfect.2012online降低血培养污染率－－严格消毒•血培养瓶消毒：70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待干60秒。或70%异丙醇消毒干燥•皮肤消毒：–三步法•70%酒精擦拭静脉穿刺点30秒•1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：从穿刺点向外画圈消毒,直径3cm•70%酒精脱碘–一步法•葡萄糖酸洗必泰作用30s，或70%异丙醇消毒后自然干燥，但不适用于2个月以内的新生儿。急诊血培养污染率与工作量相关•TheUniversityofMichiganHealthSystem急诊•血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生•采血员:病人=1:9，重症区护士:病人=2:3，其它区域护士:病人=1:4•年病人量82521人，采集血培养者7586人•11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7%•多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p0.001），污染率无显著差别（2.2%vs.2.6%）SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online急诊小时工作量SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online繁忙时血培养污染率增加OR=1.23OR=0.93SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online抗菌药物治疗与血流感染死亡率死亡率Chest115(2):1999血培养三级报告制度血培养阳性终报告42血培养结果回报对治疗的影响EMPIRICAFTERCx+AFTERASTASSOC.MORT(%)RELATIVERISKAAA10.51.0IAA13.31.27IIA25.82.46III33.33.18•A=AppropriateTherapy(正确治疗)•I=InappropriateTherapy(不正确治疗)ClinInfecDis24:584-602,1997血流感染快速分子诊断•分子诊断不受抗菌药物使用的影响•血培养阳性后分子诊断•直接使用血标本进行分子诊断•快速•但不能提供药敏结果血培养阳性瓶分子鉴定AntigoneKotsaki,etal.ExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209阳性血培养－基于PCR的检测•PCR特异性检测–病原特异性PCR–特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA,肠球菌van–细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数•广谱检测：PCR扩增特定靶位–多态性分析–测序–后续基因检测–种特异性real-timePCRExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.CurrOpinInfectDis.2011,24(2):137qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌•Target：ecfXgene•血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b•对照方法：氧化酶，API20E•DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法•定量PCR：–扩增：Oligonucleotideprimers–基因特异性检测：fluorescent-labeledhybridizationprobes，152bpfragmentAnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:2147qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌•33瓶pae，敏感性和特异性均为100%•1瓶kpn+pae，由于pae(20CFU/ml)≤kpn(108CFU/ml)，PCR(-)•检测限：将ATCC27853ecfX基因克隆至TOP10E.coliAnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:2148阳性血培养－基于PCR的检测•最常见病原体多重PCR–电泳谱、ELISA杂交、多重Real-timePCR–HyplexBloodScreen(BAG,Lich,Germany):多重PCR+ELISA,4.5-6h完成–Prove-ItSepsis(Mobidiag,Helsinki,Finland)：多重real-timePCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成–多重Real-timePCRExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.血培养阳性－多重real-timePCRNEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013血培养阳性－多重real-timePCRNEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013血培养阳性－PNAFISH核酸荧光原位杂交•血培养阳性肉汤革兰染色PNAFIS