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第五节核苷酸序列分析即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速。5.1.Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来•测序过程:–1.模板与引物杂交–2.引物的延长和合成阻断•四个试管分别加入DNA聚合酶dNTP标记底物•终止剂不同ddAddGddCddT•四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链–3.电泳–4.放射自显影得到直读图象5'-AACTGCTG--3'与引物退火5'-AACTGCTG--3'5'dNTPddATPdNTPddCTPdNTPddGTPdNTPddTTP5'-AACTGCTG-3'AC-5'5'-AACTGCTG-3'C-5'5'-AACTGCTG-3'GAC-5'5'-AACTGCTG-3'TGACGAC-5'5'-AACTGCTG-3'CGAC-5'5'-AACTGCTG-3'CGAC-5'5'-AACTGCTG-3'GACGAC-5'5'-AACTGCTG-3'TTGACGAC-5'2+51+43+67+8ddddddddddddddddAGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一种标记的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs处5’反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示.TCGA3’CCTTTAGCT5’5.2Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。一、化学裂解法测序的原理1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C化学法读序每组测序图谱为4条垂直的阶梯带，该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内化学裂解法的特点•优点：1、所测序列直接来源于所测DNA，避免了DNA复制中错误dNTP的掺入。2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究DNA的二级结构及蛋白质与DNA的相互作用等。•缺点：操作复杂，读序困难。5.3DNA测序自动化和大规模测序特点原理同末端终止法标记物为荧光染料激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快200bp/hDNA自动测序与手工测序的不同点1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳，提高电泳分析的效率3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑DNA序列测定的自动化1.DNA测序步骤与自动化1）模板制备可自动化2）定序反应可自动化3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化2.自动测序仪Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。“分子生物学研究方法”思考题：1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNA片段的范围有何不同？2、电泳操作的基本程序有哪些？3、核酸的分子杂交的概念？Southern印迹法、Northern印迹法和Western印迹法的检测对象分别是什么？4、什么叫探针（Probe)？5、PCR定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？6、核酸测序的常用方法有哪些？