凝集反应-ELISA

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资源描述

1免疫学实验课贵阳医学院免疫学教研室21、试管凝集反应(示教)2、ABO血型鉴定--玻片凝集反应(1份/1人)3、类风湿因子检测--乳胶凝集实验(示教)4、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人)实验内容3实验二凝集反应(Agglutination)4实验原理颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体,或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体,形成致敏颗粒,与相应抗体/抗原在一定的条件下,形成肉眼可见凝集小块的反应,称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原(agglutinogen),抗体称为凝集素(agglutinin)。5凝集反应类型直接凝集反应(directagglutination)颗粒性抗原与相应抗体直接结合,所出现的凝集现象,包括试管凝集反应、玻片凝集反应。间接凝集反应(indirectagglutination)将可溶性抗原(或抗体)吸附在与免疫无关的载体颗粒表面,使此颗粒致敏(免疫球),然后再与相应抗体(或抗原)混合,在适当条件下,发生凝集现象,称为间接凝集反应或被动凝集反应。67操作步骤于试管架上列7支试管。1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。2.血清稀释:第一管加入1:10待检血清0.5ml,混匀后取0.5ml,加入第二管内,依此类推,直到第6管,混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去;第7管为对照管。0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml(一)试管凝集反应83.每管加伤寒杆菌“H”抗原0.5ml。4.混匀,置52℃水浴4h,取出后,置室温过夜,次日读取凝集效价。9结果观察不同程度的凝集现象:++++:液体澄清,细菌全部凝集(100%),沉于管底形成大片凝集物。+++:液体基本澄清,细菌大部分凝集(75%左右),管底的凝集物稍小。++:液体半澄清,稍显浑浊(凝集物50%左右),但仍可见明显凝集块。-:液体浑浊,无凝集块,轻摇试管,有细菌呈絮状浮起。10效价:抗原抗体反应时,发生明显反应的最高血清稀释度,又称滴度。凝集效价:凝集反应时,能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。11(二)玻片凝集反应已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上,在一定的条件下,若两者相对应,则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析,如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。ABO血型系统2020/2/281213ABO血型鉴定步骤红细胞悬液的制备(用于血型鉴定及ELISA实验)1.取EP管1支分装适量生理盐水2.消毒耳垂或手指皮肤3.用采血针采1-2滴血,加入盛有生理盐水的EP管中混匀(待测抗原)取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张,分别加入待测抗原各1滴,并用牙签混匀。置室温5分钟左右观察结果。1415注意事项用牙签研磨时,注意防止将抗A血清带到抗B血清中,反之亦然。如果凝集现象不太明显时,可用显微镜观察。16类风湿因子(RF)的检测RF是抗人变性IgG的IgM类抗体,将变性IgG包被于乳胶颗粒上,此致敏乳胶颗粒与待测血清结合时,如血清中存在RF,即可出现凝集小块。(三)乳胶凝集试验17操作步骤1.在凝集反应板中取4孔分别加入阴性血清、阳性血清、生理盐水、待检血清各1滴2.每孔分别加入致敏胶乳1滴,充分混匀,置室温5-10分钟观察结果。18免疫标记技术将已知抗体或抗原标记上易示踪物质(如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等),通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应,从而测出微量的抗原或抗体。19实验五酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbsentAssay,ELISA)【原理】利用标记技术将酶标记到抗体(抗原)上,使待检物中相应的抗原(抗体)与酶标记抗体(抗原)发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时,酶分解底物,生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原(抗体)以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。20直接ELISA:包被(未知抗原)加入酶标抗体洗板加底物加终止液21间接ELISA:包被(已知抗原)加入待检标本(未知抗体)加入酶标第二抗体﹙抗抗体﹚洗板加底物加终止液间接ELISA原理23双抗体夹心法ELISA:加入待检标本(未知抗原)加入酶标抗体洗板加底物加终止液包被(已知抗体)双抗体夹心法ELISA原理25乙型肝炎病毒表面抗体的检测——间接ELISA法【测定原理】采用纯化HBsAg包被反应板,加入待检标本,当标本中存在抗-HBs时,该抗体与包被HBsAg结合,再加入酶标羊抗人IgG抗体。最后形成HBsAg-抗HBs-酶标抗抗体复合物,加入底物产生显色反应。26无菌采血,离心2000rpm,3min,取上清作为待测标本每孔加入酶结合物1滴,37℃孵育30min反应板中加入待测标本,同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS)(反应板已用纯化HBsAg包被)手工洗板,弃液拍干,重复5次每孔加入显色剂A液、B液各1滴,置37℃孵育15分钟每孔加入终止液1滴,混匀目测法:与阳性和阴性对照比较,观察颜色深浅判断结果【步骤】2020/2/2827

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