第三章 细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法•显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学，细胞生物学的变革无不和显微技术的改进息息相关。•1590年J.和Z.Janssen父子制作第一台复式显微镜，放大倍数不超过10倍。•1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska发明了第一台电子显微镜研究技术、研究工具促进细胞生物学科的发展显微镜的出现——细胞学说的建立电子显微镜技术——进入超微与分子形态水平超离心技术细胞成分、代谢过程的同位素示踪技术精确定性、定量分析单克隆抗体、分子杂交——生物工程第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜一、光学显微镜技术1、普通复式光学显微镜技术2、相差显微镜技术3、荧光显微镜技术4、激光共焦点扫描显微镜技术人眼100um1cm1mm100um10um1um100nm10nm1nm0.1nm光学显微镜电子显微镜扫描隧道显微镜细菌病毒核糖体球蛋白原子植物、动物细胞可见范围1、普通复式光学显微镜技术1）光学显微镜的组成光学放大系统照明系统机械和支持系统目镜物镜光源折光镜聚光镜（滤光片）2）分辨率指区分开两个质点间的最小距离。D=0.61N.Sin/2：光源波长：物镜镜口角（最大值可达140度）N：介质折射率（空气中为1）N.Sin/2也称数值孔径(镜口率)分辨率与光源的波长、物镜镜口角和介质折射率有关。几种介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66成像原理样品被放置在光的通路中，样品会对光波产生干扰，这种干扰现象通过透镜被肉眼观察到。为什么分辨率与光波波长有关？照明系统的波长是显微成像的一个重要因素，波长决定能被检测样品的最小极限。最大分辨率以可见光作光源，其最大的分辨率为：最好的玻璃透镜的镜口角是140°，sin/2的最大值为0.94,空气的折射率为1,最短的可见光（蓝色光）的波长为450nmD＝292nm用油作为光折射的介质:D=0.2μm(光学显微镜最大分辨率)用紫外光作光源可使D提高到约0.1μm。分辨极限与有效放大率对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2μm，这是分辨极限。有效放大率：光学显微镜的分辨率约为0.2μm，人眼的分辨率为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。3）光学显微镜样品制备固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成分固定剂：甲醛、戊二醛包埋：为了便于切片，防止样品移位。石蜡或树脂染色：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征切片：1～10μm光线通过细胞后的变化2、相差显微镜发明：1934~1935荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。优点：样品不需染色，可以观察活细胞。原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。相差：在某一时间上，光的波动所能达到的位置，便是它的相位；两组波的相位不同，即相差。xy透明玻璃产生相位差产生振幅差Z有明暗之分吸光物质相差显微镜的结构•聚光器或光源上增加一环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；•物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊吸光物质；•偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用；吸光区半透明圆环不透明的涂漆部分透明的环状部分用途：观察未经染色的玻片标本。3.荧光显微镜Fluorescencemicroscope•特点：光源为短波光；•有两个特殊的滤光片：•第一：激发滤片•第二：阻断滤片荧光显微镜Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen•用于观察能激发出荧光的结构。•用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。荧光显微镜及其照片荧光显微镜技术1）分为：免疫荧光技术荧光素直接标记技术2）原理：（以免疫荧光技术为例）特定抗原（细胞）抗体抗体－抗原复合物进行定位测定荧光素激发光不同的荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素（如：紫外线）3）局限性：固定剂常会破坏抗原性；包埋剂常会产生自发荧光。4、激光共焦点扫描显微镜技术原理：•是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；•物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点，极大的增加了对比度；•逐点、逐行、逐面快速扫描，形成立体图像，能显示细胞样品的立体结构；效果：使观察到的图像反差和分辨率提高分辨率比普通荧光学显微镜提高1.4~1.7倍。激光共焦点扫描显微镜的原理图共聚焦显微镜及其显微图像免疫荧光显微镜技术（A）和激光扫描共焦显微镜技术(B)的比较其他常用光学显微镜•倒置显微镜•其结构组成与普通显微镜一样，所不同的是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来，物镜在载物台的下方，可直接对培养的细胞进行照明和观察。暗视野显微镜darkfieldmicroscope•聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。•可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。当代显微镜的发展趋势•采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体；•自动化与电子化。二、电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识1、基本构造•电子束照明系统：电子枪聚光镜•成像系统物镜中间镜投影镜•真空系统•记录系统（电磁透镜）名称可见光紫外光X射线α射线电子束0.1Kv10Kv波长（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122不同光线的波长•电子显微镜的分辨率为0.2nm，放大倍数可达百万倍；2.电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空成像原理光学显微镜200nm100nm可见光(波长400-700nm)紫外光(波长约200nm)玻璃透镜玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电子显微镜接近0.1nm电子束(波长0.01-0.9nm)电磁透镜要求真空利用样品对电子的散射和透镜形成明暗反差（二）主要电镜制样技术1、超薄切片技术•切片厚度一般仅为40～50nm1.固定：锇酸（OsO4）和戊二醛等；2.包埋：环氧树脂；3.切片：4.染色：重金属盐；形成明暗反差电镜生物样品制备过程固定清洗后系列梯度丙酮或酒精脱水浸泡于稀包埋剂中包埋剂样品杆用玻璃刀或钻石刀切片切片机修块包埋块置温箱中包埋剂聚合收集切片于载网上重金属染色置电镜下观察2、负染技术•用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria3、冷冻蚀刻电镜技术基本操作过程：•将标本在标本台上于－196℃的液氮中超低温迅速冰冻；防止形成冰晶。•用冷刀将冻结的标本骤然断开；•当温度上升后，冰在真空条件下迅速升华，断裂面上的结构得以暴露（蚀刻）；•再喷涂上一层蒸气铂和碳；•将样品本身溶解掉，把喷涂上的碳和铂的膜剥离下来（复膜）；•电镜观察。冷冻蚀刻技术主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。样品不需包埋、固定。能更好地保持样品的真实结构。培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin衣被3、扫描电镜技术工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出二次电子，二次电子的多少与样品表面形貌有关，二次电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题•为了使标本表面发射出二次电子信号，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜。RedbloodcellYeast人类精子三、扫描隧道显微镜•原理：利用量子力学中的隧道效应（通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止电流通过，称为叠势）当二电极之间近到一定距离（100nm以内）时，电极之间产生了电流，称为隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系。将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。特点：1.原子尺度的高分辨率；2.可在真空、大气、液体等多种条件下工作；3.非破坏测量；扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构STMimageofaDNAmolecule第二节细胞组分的分析方法一、离心技术二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法三、放射自显影技术四、分子杂交技术五、定量细胞化学分析技术一、离心技术•差速离心•密度梯度离心•是分离细胞器及各种大分子基本手段。•转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。•转速30kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。•超速离心机的最高转速可达150000r/min，离心力超过500kg。方法：（一）差速离心利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。原理:在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降的速度也不同，体积大的沉降的快，反之沉降的慢。•用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。结构离心力细胞核800－1000g线粒体20,000-30,000g叶绿体20,000-30,000g溶酶体20,000-30,000g微体20,000-30,000g粗面内质网50,000-80,000g质膜和光面内质网80,000-100,000g游离核糖体、病毒粒子150,000-300,000g不同的细胞结构分离所需的离心力•沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。（二）密度梯度离心•用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将分离的细胞组分小心置于介质的顶部，通过离心力场的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带，从而将细胞成分分层、分离。•类型：速度沉降、等密度沉降。•常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。1.速度沉降velocitysedimentation•用途：分离密度相近而大小不等的细胞组分。•特点：介质密度较低。•原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降isopycnicsedimentation•用途：分离密度不等的颗粒。•特点：1）介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。2）力场比速度沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。•原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。密度梯度离心法与差速离心法二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，常利用一些显色剂与所检测物质中特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。DNAFeulgen反应多糖PAS反应如淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。脂类苏丹染色等蛋白质Millon反应三、放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。四、分子杂交技术•具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。•原位杂交（insituhybridization）。•用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。人类染