分子克隆工具酶

基因工程第二章分子克隆工具酶第二章分子克隆工具酶教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种工具酶:限制性核酸内切酶、甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、碱性磷酸酶。通过本章的学习要求掌握限制性内切酶和甲基化酶的种类及性质，聚合酶、连接酶、核酸酶的工作特性;理解生物的限制与修饰现象以及复制、转录等生物学现象；了解琼脂糖酶，蛋白酶等其他酶的生物学功能。重点、难点：限制性内切酶和甲基化酶的种类及性质。教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等本章思考题：1.限制性内切酶可划分哪些种类,各有什么特点?2.影响限制性内切酶酶切的因素有哪些？3.DNA聚合酶有哪些种类,各有什么特点?4.连接酶的种类有哪些?主要参考资料:1.吴乃虎主编.基因工程原理.北京:科学出版社，19982.陆德如,陈永青主编．基因工程.化学工业出版社,20023.马建岗主编.基因工程学原理.西安:西安交通大学出版社,20014.南开大学生物技术试验室译.genesVII基因工程技术的建立与各类能切割和连接DNA和RNA的酶的发现密切相关。在基因工程技术中，将能用于DNA和RNA的切割和连接的有关的各种酶统称为工具酶。由于限制酶的发现与应用而导致体外重组DNA技术的发展，使我们有可能对真核染色体基因的结构、组织、表达及进化等问题进行深入的研究。用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶甲基化酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶碱性磷酸酶第一节限制性内切酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase），而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）。限制性核酸内切酶,又简称为限制性内切酶或限制酶,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。寄主控制的限制与修饰现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的,一种是核酸内切限制酶,另一种是修饰的甲基转移酶。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。一、限制性内切酶的命名在20世纪60年代，人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EcoRIEscherichiacoliR大肠杆菌R株二、限制性内切酶的种类限制性内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，到目前为止，已经从近1000多种不同的微生物中分离出了近5000种限制酶和甲基化酶。根据限制性内切酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，目前已鉴定出有3种不同的类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。这3种类型的限制酶具有不同的特性。（基因工程技术中常用Ⅱ型）Ⅰ型酶这类酶的种类较少，只占已发现的1%。结构都是多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能。它们作用时需ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸(SAM)的存在。这种酶切割DNA的方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1000-5000个核苷酸的距离后，此酶仅在似乎随机的位置上切割一股单链DNA，造成大约75个核苷酸的切口。这类酶不能专门切割DNA的某种特殊位点，（有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的）因此在基因工程中用处不大。Ⅲ型酶这类酶的种类更少，还不到已发现的1%。其中某些限制性内切酶如MboⅡ有独特的识别方式和切割办法，它能识别GAAGA序列，但不存在二分体式的对称。它能在DNA的每条链上从识别序列的一侧开始测量一定距离(分别为8个和7个核苷酸)后进行切割:产生仅一个碱基凸出的3’末端。EcoP1和EcoP15识别位点是AGACC和CAGCAG，切割位点在下游24-26bp处。这类酶切割位点没有特异性，因此在基因工程操作中的作用也不大。Ⅱ型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来第一种Ⅱ型酶。这类酶的种类最多，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，分子量较小只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3’-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，切割位置因酶而异。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点4-6bp，大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需要ATP否是是三、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，一般为6个。随机情况下，识别4个时256个碱基会出现一个识别位点（44=256），识别6个时4096个碱基会出现一个识别位点。4个碱基位点识别：Sau3AⅠ:GATC5个碱基位点识别:EcoRⅡ:CCW(A或T)GG6个碱基位点识别:EcoRⅠ:GAATTCHindⅢ:AAGCTT7个碱基位点识别:BbvCⅠ:CCTCAGC8个碱基位点识别:NotⅠ:GCGGCCGC2、限制酶识别序列的结构限制酶识别序列大多数为回文对称结构。某些识别序列为非对称的，如：AccBSⅠ:CCGCTCBssSⅠ:CTCGTGGGCGAGGAGCAC许多酶可以识别多种序列，如：AccⅠ:GTM(A/C)K(G/T)AC有些酶识别序列是间断的，如：AlwNⅠ:CAGNNNCTGGTCNNNGAC5’…GCTGAG…3’3’…CGACTC…5’GAATTCCTTAAGEcoRI的切割位点EcoRI的识别序列3、限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置一般在内部，但也有在外部的。在外部的又有两端、两侧和单侧之分。两端：EcoRⅡ:CCWGG两侧：TspRⅠ:NNCASTGNNNNGTSACNNBcgⅠ酶的切割特性比较特殊，在识别位点的两端各切开一个断点（形成两个断点）。四、限制酶产生的末端1、匹配黏端（黏性末端）黏性末端是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过这种末端的碱基互补，使不同的DNA片段发生退火。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAG+GATCCG退火GGATCCCCTAGG2、平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率比黏性末端低。+HindⅡGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG3、非对称突出末端当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，称为非对称突出末端。+BbvCⅠCCTCAGCGGAGTCGCCGGAGTTCAGGCG4、同裂酶来源不同但识别相同序列限制酶称为同裂酶，又称同功异源酶。但它们的切割位点可能不同。同序同切酶：识别序列和切割位置都相同。同序异切酶：识别序列相同但切割位置不相同。同功多位：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。其他：有些限制酶识别的序列相互交叉。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAG+GATCCGBstⅠGGATCCCCTAGGGCCTAG+GATCCGKpnⅠGGTACCCCATGGGGTACC+CCATGGAcc65ⅠGGTACCCCATGGGCCATG+GTACCG5、同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCACCTAGGACTAGT五、影响限制性核酸内切酶活性的因素1、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶在切割DNA时对识别序列的非识别序列有长度的要求，即识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。（一般在识别序列末端有3-4个碱基对时能满足常规的酶切要求）2、位点偏爱某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称为位点偏爱。3、酶切反应条件⑴缓冲液核酸内切限制酶标准的缓冲液①氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg2+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。②Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。③β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。④牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。不同的内切酶对离子强度、PH有不同的要求，一般按离子强度不同将缓冲液分为低、中、高盐三类。对DNA进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用两种酶都适用的缓冲液或通用缓冲液；如找不到共用的，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。⑵温度内切酶一般的最适反应温度为37℃，但也有例外，部分为50-65℃，少数为25-30℃，如TaqI的正常反应温度为65℃,SmaI的为25℃。⑶反应时间内切酶的反应时间一般为1-1.5h,适当延长时间可减少酶的用量，如EcoRI反应16h，酶用量只需正常的1/8。⑷终止酶切的方法利用EDTA螯合镁离子、加热等方法可有效终止酶切反应。⑸DNA的纯度和结构DNA样品中所含蛋白质、有机溶剂以及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度。酶切的底物一般是双链DNA,DNA的甲基化位置也会影响酶切反应。DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内切酶切割位于DNA不同部位的限制位点上，其效率亦有明显的差异。六、酶切位点的引入在酶切水平上，通过酶切和连接可产生新的酶切位点。1、将产生的5’突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点。…GAATTC……GAATTAATTC……GAATTAATTC……CTTAAG……CTTAATTAAG……GAATTAATTC…补平连接EcoRⅠ