13.1-荧光免疫技术解析

第十三章荧光免疫技术第一节概述荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。一、荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=发光强度）吸收光的光量子数（激荧光强度）发射荧光的光量子数（荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光的基本知识荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FL荧光的基本知识荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质二、荧光物质第二节荧光抗体技术荧光抗体技术的基本原理荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查抗体要求高特异性高亲和力经纯化提取IgG一、荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。荧光抗体的制备去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释nmnmAAA495280495nm35.087.2荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备-20℃：保存1～2年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本的类型二、标本的制作冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的类型标本的制作固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃标本的固定和保存标本的制作直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色及结果判断双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断“-”：无或仅见极微弱荧光。“+”：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈++的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。四、荧光显微镜的基本结构光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头荧光显微镜荧光显微镜的基本结构隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片荧光显微镜的基本结构透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型荧光免疫测定的方法类型非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠stokes位移基本原理时间分辨荧光免疫测定发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高基本原理发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高基本原理荧光标记物的相对比活性时间分辨荧光免疫测定结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标记抗原抗体复合物基本原理信号增强时间分辨荧光免疫测定镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标记物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质的荧光寿命时间分辨荧光免疫测定标记方法双功能螯合剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）标记方法：一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+时间分辨荧光免疫测定方法类型双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。时间分辨荧光免疫测定方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质基本原理二、荧光偏振免疫测定抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图基本原理荧光偏振免疫测定方法评价样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定基本原理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。三、荧光酶免疫测定酶和荧光底物荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物标记酶底物荧光产物激发光(nm)荧光(nm)相应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定方法类型双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法荧光酶免疫测定方法类型双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图荧光酶免疫测定方法类型双抗原夹心法固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。荧光酶免疫测定方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。荧光酶免疫测定方法评价用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相荧光酶免疫测定效果好荧光酶免疫测定第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、荧光抗体技术的应用②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用④细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。⑤特殊应用：流式细胞分析荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。荧光抗体技术的应用时间分辨荧光免疫测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等荧光偏振免疫测定：药物、维生素、激素、常规生化项目等荧光酶免疫测定：病毒抗体、细菌和毒素