高效液相色谱法

第十五章高效液相色谱法15.1概述15.1.1经典液相色谱法和高效液相色谱法经典：柱效低高效：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。15.1.2高效液相色谱法和气相色谱法GC：样品需先气化，对挥发性差的物质要求高气化温度和高柱温，给设备带来困难。高分子化合物、热稳定性差的化合物和生化样品在气化中分解、失活。GC中流动相分子与分离物质分子间作用小，改变流动相无法提高选择性。HPLC：一般在室温下操作，试样只需在流动相中有一定溶解度。不受样品挥发性和热稳定性限制。适于分离沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。可通过改变流动相和固定相来提高选择性。15.1.3高效液相色谱法的分离类型分离类型分离对象备注相对分子量极性溶解性吸附色谱法102至5*103非极性或弱极性溶于非极性溶剂，在水中溶解度很差用于异构体的分离分配色谱法正相液相色谱法极性较强溶于烃类、氯仿等有机溶剂，在水中溶解度很差用于同系物的分离反相液相色谱法极性范围广溶于极性溶剂（水、醇），但不离解离子交换色谱法离子型溶于水且能离解，或不溶于水，但溶于HCl或NaOH溶液体积排除色谱法凝胶渗透色谱法103至106非离子型溶于低极性的有机溶剂合成高聚物凝胶过滤色谱法溶于水天然高分子15.1.4HPLC中影响谱带扩张的主要因素HPLC的速率方程：H=A+B/U+CU1.由于流动相为液体，组分分子在流动相中的扩散系数很小，因此B/U分子扩散项的影响可忽略。2.CU传质阻力项是影响谱带扩张的主要因素。而传质阻力的大小与填充剂颗粒的平均直径成正比，因此填充颗粒大小成为影响谱带扩张的主要因素。3.HCLP中除色谱柱以外的流路部分仍有由于进样不当，管道死体积，柱后扩散等造成的柱外效应引起谱带扩张。15.2高效液相色谱仪15.2.1流程1.输液装置：储液瓶、高压输液泵、梯度洗脱装置2.进样系统3.色谱柱4.检测器15.2.2主要部件高压输液泵：主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性溶液进入高压输液泵之前应先过滤除去细微颗粒避免堵塞；并预先脱气，以免柱中或柱后的压力下降是溶解在流动相中的空气逸出气泡影响分离、检测。进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。高效分离柱：柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。高效液相色谱检测器：光学式（紫外/可见吸收、荧光、视差折光率）电化学式介电常数式总体性能检测器、溶质性能检测器15.3吸附色谱法吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。分离原理：样品在硅胶色谱柱中的保留作用受两个因素控制：1.样品分子和流动相分子对硅胶表面羟基的竞争吸附，即流动相极性大，硅胶间相互作用强，则溶质吸附越弱，保留值小。2.流动相对样品的溶解能力，若流动相对组分有叫大溶解度，则组分的保留时间短。在吸附色谱中决定样品分子吸附作用的首要因素是样品分子的官能团，官能团极性增加或极性官能团增多样品与硅胶的吸附作用增强。因此吸附色谱法对同系物的选择性小而利于族分离。二氯代苯的保留时间由大到小为：硝基甲苯保留时间由大到小为：2，3-二氯代-2-丁稀保留时间由大到小：：溶剂的极性：指溶剂分子与溶质分子之间总的相互作用力。溶剂的强度：指溶剂洗脱色谱柱内组分的能力。溶剂强度参数ε0：以溶剂为流动相在选定的吸附剂上的洗脱能力大小，相当于每一单位面积吸附剂表面上溶剂的吸附能。洗脱序列：ε0越大洗脱能力越强。溶剂己烷氯仿乙酸乙酯甲醇水乙酸溶剂强度ε00.000.260.380.73大于0.73大于0.73采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。对组分复杂的样品可采用梯度洗脱：分离过程中逐渐增加ε0值15.4分配色谱法正相液相色谱法（NPLC）：固定相极性较流动相强的液相色谱法。反相液相色谱法（RPLC）：固定相极性较流动相弱的液相色谱法。色谱操作正相色谱反相色谱固定相极性非（弱）极性流动相非（弱）极性极性流出次序极性组分k’大极性组分k’小流动相极性影响极性增加，k’减小极性增加，k’增大溶剂洗脱顺序与洗脱强度顺序一致与洗脱强度顺序相反正相液相色谱k’：反相液相色谱k’：大小小大例：例：己烷甲醇乙酸正相色谱洗脱顺序：反相色谱洗脱顺序：小大大小15.5离子交换色谱法（IEC）IEC以离子交换剂作为固定相，离子交换剂是一种具有可交换离子的聚合电解质，能参与溶液中离子的交换作用而不改变本身一般的物理特性。分为：高分子树脂、薄壳型离子交换剂、离子交换键合相。机理（以强酸性阳离子交换树脂为例）：双柱：薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm，在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。15.6体积排除色谱法（SEC）体积排除色谱法是用化学惰性的多孔物质为固定相，试样组分按分子体积分离的液相色谱法。分为：凝胶渗透色谱法（GPC）：以有机溶剂作流动相，多用于高分子领域，测定聚合物分子量分布或跟踪聚合物合成、降解反应。凝胶过滤色谱法（GFC）：以水或水溶液为流动相，多用于生化领域分离天然高分子。