高效液相色谱法1

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC内容•高效液相色谱简介•高效液相色谱分类•高效液相色谱的测定流程•高效液相色谱应用•高效液相色谱的展望主要内容简介高效液相色谱（HPLC）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC的发展史HPLC的特点1）高压（150－350*105Pa）2）高速3）高效4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光10-11g）HPLC和GC的对比经典LC与HPLC比较经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天~10minHPLC分类•液---液色谱•液---固色谱•离子交换色谱•排阻色谱•亲和色谱HPLC的仪器配置和流程HPLC的图形结果---色谱图HPLC的应用由于高效液相色谱具有高速、高效、高灵敏度等特点，近年来，国内外许多专家学者将高效液相色谱技术应用于天然产物（主要是中药）、农药和食品等行业中，取得了明显的效果。下面从实例出发，分析高效液相色谱分析方法在一些方面的应用：1、高效制备液相色谱在天然产物分离中的应用天然产物（主要是中药）种类繁多,所含化学成分种类丰富,且有不少结构相似而含量高低不一,采用常规方法难以进行分离、精制。而HLPC的高灵敏性和高效性使其能有效地分离纯化某些天然产物中的有效成分。如表2列出的便是其中几种。已有文献对利用HLPC分离一些天然产物进行了报道，如黄酮类化合物（如下表所示）、苷类化合物、有机酸类化合物和生物碱类化合物等等。2020/2/282020/2/282、液相色谱技术在农药残留检测中的应用液相色谱法是一种经典的分析方法,由于其具有操作简便分析速度快分离效能高、灵敏度高以及应用范围广等特点。目前农药残留物检测70%采用液相色谱法来进行,使用液相色谱法，多种农药可以一次进样，得到完全的分离定性和定量，再配置高性能的检测器使分析速度更快结果更可靠。试验测定稻米中吡虫啉农药残留，样品经高速匀浆提取、florisil柱净化，在269nm波长下，采用高效液相色谱(HPLC)法分离测定。结果表明，吡虫啉回收率为81.90％~87.80％相对标准偏差在3.24%~4.51%，方法最低检出限为0.0016mg/kg，该方法的准确性、精确性以及灵敏度均达到农药残留分析的要求。2020/2/283、高效液相色谱在食品行业中的应用高效液相色谱法在食品化学分析方面的应用已较为普及，HPLC可以广泛地用于检测食品的农药残留，食品中过量的食品添加剂，食品中违禁成分；也可用于食品中营养成分的分析。如：乳品的风味物质药物残留和毒物种类及含量等多个方面；肉制品中的兽药残留致癌物质含量等。2020/2/28高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量三聚氰胺(melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料，为白色或无色结晶,通常用于塑料制品中合成树脂的生产。近年来，一些不法厂商将三聚氰胺添加到奶粉中，以增加蛋白质含量。2008年9月,震惊中外的“三鹿婴幼儿奶粉事件”暴露出乳制品行业的“潜规则”，国内一些知名乳品品牌也被检出其产品中含三聚氰胺。因此，如何快速、准确分析乳制品中的三聚氰胺成为多方关注的问题。2020/2/28高效液相色谱法测定奶粉和液态奶中的三聚氰胺1.1材料、仪器：Water公司2695型高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器）；色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×200mm,5µm);SCX固相萃取柱。三聚氰胺，氨水，甲醇，一级纯水。1.2样品前处理：1）配成标液2）提取：称取奶粉1g或液态奶2g，置于50ml离心管中，加入25ml10g/L氯乙酸溶液，混合离心15min，移取上清液3）净化：采用阳离子交换固相萃取柱进行净化。1.3色谱条件：流动相：乙腈0.01mol/L庚烷磺酸钠(pH3.3)(体积比为10:90),流速1.0mL/min;；检测波长：236nm；柱温：40°C；进样量：20µL。以保留时间定性，外标法定量。2020/2/28•结果与讨论2.1色谱条件的优化1）检测波长：将配制好的三聚氰胺标准溶液进行光谱扫描，发现在236nm处有最大吸收，故确定检测波长为236nm。2）流动相：根据其化学性质，可采用离子对试剂作为流动相进行分离。以庚烷磺酸钠作为离子对试剂时三聚氰胺的保留时间相对较长，有利于干扰峰的消除，因此选择庚烷磺酸钠作为离子对试剂。2020/2/282.2前处理方法的选择及干扰的消除1)加入重金属盐类和降低酸度都可以使奶制品中的蛋白质沉淀。本实验采用的是三氯乙酸溶液。2）提取方式的选择:采用在室温下涡旋提取2min的提取方式。3）净化方式的选择：根据三聚氰胺的化学性质，采用阳离子交换固相萃取柱进行净化。2020/2/28•3.实际样品的测定2020/2/28高效液相色谱的展望•1.缩短分析时间,提高分离效率。应用先进的检测仪器和方法,对流动相、固定相进行调节或改变,采用梯度洗脱、柱切换技术有望解决这个问题。梯度洗脱的高效液相色谱法,能分析较宽极性范围的样品,较等度洗脱具有很大的优势,但对于成分更复杂、极性范围更宽的中药样品则有些力不从心。多柱高效液相色谱法又称多维高效液相色谱法。除具有梯度洗脱一样的改变流动相浓度的优点外,还可以改变固定相种类、键合度、粒径、柱长、柱径等及流动相种类、浓度等。2020/2/28•2.进一步向自动化、智能化及联用技术上发展。液相色谱与质谱联用在国外已成为测定低浓度生物药品中药物及代谢物的首选方法,LC-MS-MS法测定血浆中HIV-1蛋白酶,准确高效,血浆中残留的内源性组份和其他药物不干扰测定,既节省材料又节约时间。已经应用于体液、血浆、血清中的药物分析。高效液相色谱-核磁共振联用在药物分析方面的作用很不错。新近提出的智能多柱高效液相色谱系统利用切换技术的模块式分离性能,把样品分块的切换进不同性质的色谱柱,再用合适的流动相洗脱。全过程采用智能化控制。谢谢