RNA提取-TAKARA(1)

研究用CodeNo.9108/9109说明书RNAisoPlus（TotalRNA提取试剂）v201412Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●RNA提取实验前的准备1●实验操作2●RNA提取操作流程图3●RNA纯度分析4●Troubleshooting4●参考文献5●相关产品5●制品说明本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA。样品在RNAisoPlus中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（鲜红色下层，含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量DNA），RNA分布在上清层中，收集上清层，注意不要收集中间层，经异丙醇沉淀便可以回收得到TotalRNA。使用RNAisoPlus，TotalRNA的提取过程可在1小时内完成。提取的TotalRNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可以直接用于Northern杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR*等各种分子生物学实验。*：如果用于RT-PCR实验，即使有少量的基因组DNA也会影响实验结果，因此，实验前应使用RecombinantDNaseI(RNase-free)（CodeNo.2270A）进行处理。●制品内容RNAisoPlus(CodeNo.9108)*100mlRNAisoPlus（CodeNo.9109）*200ml*RNAisoPlus中含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。【试剂盒之外所需准备试剂】◆氯仿◆异丙醇◆75%乙醇（DEPC处理水配制）◆RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。）●保存4℃。避光保存以保持活性。●RNA提取实验前的准备1、尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。2、使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。如果使用的试剂不能高温高压灭菌，请使用高压灭菌后的仪器盛装，无菌过滤后使用。3、请使用一次性塑料手套和口罩进行所有试剂配制和实验操作，以避免RNase污染。-1-●实验操作1.RNAisoPlus的使用量情况如下：*1:从骨及软骨提取的RNA时，可选择High-SaltSolutionforPrecipitation(Plant)(CodeNo.9193)和RNAisoPlus配套使用*2:从含有大量多糖的植物样本提取时，可选择Fruit-mate®forRNAPurification(CodeNo.9192)和RNAisoPlus配套使用*3:从酵母中提取RNA时，可选择YeastProcessingReagent(fortotalRNApreparation)(CodeNo.9089)和RNAisoPlus配套使用2.实验样品的研磨和匀浆。A.贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。②每10cm2生长的培养细胞中加入1-2ml的RNAisoPlus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面。NOTE：对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞。③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温（15-30℃）静置5分钟，然后从核蛋白中分离RNA。B.悬浮培养细胞①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000g4℃离心2分钟，弃上清，注意不要破坏细胞沉淀。②向每5×106个细胞中加入1ml的RNAisoPlus。③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温（15-30℃）静置5分钟，然后从核蛋白中分离RNA。C.动物组织、植物材料样品①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。可以向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAisoPlus。对于新鲜的组织样品，立即加入RNAisoPlus，充分匀浆。②将匀浆液转移至离心管中，室温（15-30℃）静置5分钟。③12,000g4℃离心5分钟。④小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。3.TotalRNA的提取。①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。-2-样品量RNAisoPlus使用量（ml）10cm2的贴壁培养细胞1-25×106-1×107的非贴壁培养细胞1100μl的白细胞250～100mg的组织样品（易提取RNA）150～100mg的组织样品（不易提取RNA，如肝、脾、骨及软骨*1等）215～30mg的植物材料*2（多糖和多酚含量不高的）12～5×107的酵母细胞*31②室温静置5分钟。③12,000g4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。④吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。⑤向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。⑥12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。4.RNA沉淀的清洗。小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500×g4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。5.RNA的溶解。打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。NOTE：不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解。●RNA提取操作流程简图*：组织样品必需步骤-3-适量的动植物组织或培养细胞室温静置5分钟加入1/5RNAisoPlus体积量的氯仿室温静置5分钟将上清液转移至新的离心管中室温静置10分钟用与RNAisoPlus等量的75%乙醇清洗沉淀弃上清保留沉淀溶解于适量的DEPC处理水中加入适量的RNAisoPlus后匀浆振荡混匀12,000g4℃离心15分钟加入0.5-1倍RNAisoPlus体积量的异丙醇12,000g4℃离心10分钟7,500g4℃离心5分钟干燥（不可加热干燥）12,000g4℃离心5分钟*上清转移至新的1.5mltube中*●RNA纯度分析1.用琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖+溴乙锭）分析电泳用于分析按以上方法提取获得的1-2μg热变性totalRNA。对于没有降解的RNA可能是2种核糖体RNA（真核细胞：28S和18S），条带亮度约为2:1。但如果核糖体RNA条带弥散，说明可能RNA已降解。此外，如果条带大小超过28S，可能存在基因组DNA污染，建议使用DNaseI处理。2.吸光度分析用TEBuffer稀释RNA后测定吸光度，OD260/OD280比值在1.7-2.1为好。例：RNA浓度计算方法：RNA浓度（μg/μl）=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04●Troubleshooting1.一般情况下的组织或细胞中所能提取的RNA量如下表：组织材料起始样品量TotalRNA提取量全血*1ml15～20μg白细胞1×107个约20～40μg小鼠肝脏1g约4,000～5,000μgHL-60培养细胞1×107个约100μg烟草叶片1g约1,000μg小鼠肾脏1g约3,000μg小鼠骨骼肌1g约1,500μg小鼠脑1g约1,500μg鲤鱼骨骼肌1g约50μg*：100μl全血使用1mlRNAisoPlus如果收量少于预期，可能由于以下原因：1、加入RNAiso后研磨不充分2、三相分层时，上清液取量过少3、RNA沉淀没有完全溶解4、在异丙醇沉淀或清洗步骤存在RNase污染2.OD260/OD280值1.65，为什么？①RNA应使用TEBuffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。②样品裂解时加入的RNAisoPlus量偏少，造成蛋白分离不充分，可以再次对RNA溶液进行处理，以除去蛋白。③含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。这一步是从核酸中分离核蛋白的重要步骤。④相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。⑤RNA未充分溶解。3.提取的RNA不溶怎么办？①若75%乙醇清洗沉淀后干燥时间过长，则RNA沉淀会难以溶解。避免加热或离心干燥沉淀。②可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时可有助于沉淀溶解。4.提取的RNA降解，为什么？-4-①使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。②提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。③提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAisoPlus的添加量不够。5.提取的RNA中含有DNA污染，为什么？①裂解组织或细胞使用的RNAisoPlus量偏少。请按用量表添加或多于用量表添加。②使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等）、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。③如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用RecombinantDNaseI(RNase-free)（CodeNo.2270A）进行DNA消化。6.提取的RNA中含有多糖怎么办？大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAisoPlus的使用量。对于从含有大量多糖的植物样本中提取RNA时，推荐使用Fruit-mate®forRNAPurification(CodeNo.9192)作为预处理试剂。在异丙醇沉淀纯化步骤中加入High-SaltSolutionforPrecipitation(Plant)(CodeNo.9193)可有效除去RNA溶液中的多糖。●参考文献1．Chirgwin,J.etal.,(1979)IsolationofBiologicallyActiveRibonucleicAcidfromSourcesEnrichedinRibonuclease,Biochemistry.18(24):5294-5299.2．Wallace,D.,(1987)Large-andSmall-ScalePhenolExtractions,MethodsinEnzymology.152:33-41.3．Coombs,L.M.,Pigott,D.,Proctor,A.,Eydmann,M.,Denner,J.andKnowles,M.A.(1990)SimultaneousIsolationofDNA,RNA,andAntigenicProteinExhibitingKinaseActivityfromSmallTumorSamplesUsingGuanidineIsothiocyanate,Anal.Biochem.188:338-343.4．Nicolaides,N.C.andStoeckert,Jr.,C.J.(1990)ASimple,EfficientMethodfortheSeparateIsolationofRNAandDNAfromtheSameCells,Biotechniques,8:154-156.5．Feramisco,J.R.etal.,MolecularCloning:194-195,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.6．Raha,S.,Merante,F.,Proteau,G.andReed,J.K.(1990)SimultaneousIsolationofTotalCellularRNAandDN