tRNA合成酶-基础化学教学示范中心

第五章核酸化学核酸的概述核酸的结构核酸的性质及纯度测定核酸的生物合成与生物功能核酸化学中的几种重要技术本章要求：1.掌握核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异。2.弄清嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和核酸在分子结构上的关系。3.掌握核酸的结构，了解核酸的性质。4.认识核酸在生物科学上的重要性及其实践意义。5.掌握蛋白质生物合成的过程。第一节核酸的概述1869年Miescher从细胞核中分离出核素（nuclein）。1944年O.T.Avery等人通过细菌转化实验，证明DNA就是遗传物质。核酸是遗传变异的物质基础，是遗传信息的载体。核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）除少数病毒（RNA病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有机体的遗传物质是DNA。98％核中（染色体中）真核线粒体核外叶绿体DNA拟核原核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒DNA是遗传信息的真正携带者，兼具存储和传递遗传信息的双重功能，主要存在于细胞核内。RNA的主要作用是将DNA的遗传信息翻译并表达成具有各种功能的蛋白质，主要分布于细胞质中。DNARNA蛋白质翻译，表达转录复制脱氧核糖核酸（DNA）DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。RNA相对分子质量比DNA小得多，为单链分子。包括三种：mRNA（信使RNA）：占5%，将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地——核糖核蛋白体。tRNA（转运RNA）：占15%，翻译氨基酸信息，并将相应氨基酸转运到核糖核蛋白体。rRNA（核糖体RNA）：占80%，是核糖核蛋白体的主要组成部分，功能与蛋白质生物合成有关。核酸的化学组成核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase或嘧啶碱pyrimidinebase（碱基base）核糖ribose或脱氧核糖deoxyribose（戊糖amylsugar）核酸中的糖——核糖和脱氧核糖β-D-核糖β-D-2-脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12O含氮碱基——嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（Ade）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（Gua）HNNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（Cyt）NNHHHHOOHH尿嘧啶Uracil（Ura）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶Thymine（Thy）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式嘌呤碱和嘧啶碱分子中存在酮式-烯醇式或氨基式-亚氨基式的互变异构。核苷OHOH2COHOHOH1’2’3’4’5’NNNNH9碱基核苷1’2’3’4’5’(OH)胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2核苷酸碱基核糖或脱氧核糖磷酸脱氧核苷酸核苷酸核酸组分的表示方式•通常用3个字母表示碱基，用1个字母表示核苷。•如Ade——腺嘌呤；A——腺苷；•腺苷酸——pA（磷酸5’位）或Ap（磷酸3’位）；•B——碱基；N——核苷。ADPAMP腺嘌呤O-O-—O‖OPO-O—O‖~ATPPO-O-—O‖~腺苷-5′-磷酸P腺苷三磷酸结构OOH2COHOHOH1′2′3′4′5′NNNN9NH2核苷酸的衍生物各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用：ATP——能量“货币”；UTP——参加糖的互相转化与合成；CTP——参加磷脂的合成；GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成；第二信使——cAMP、cGMP。核苷酸的衍生物ATP和GTP•ATP：含有两个高能磷酸键，水解时释放大量自由能，可以作为推动体内各种需能反应的能量来源。•ATP是一种很好的磷酰化剂，用于活化分子。•氧化磷酸化：由储能物质氧化分解提供化学能合成ATP的过程。•光合磷酸化：由太阳能提供能量合成ATP的过程。•GTP：鸟苷三磷酸•作为蛋白质合成中磷酰基供体。•可与ATP相互转换。•cAMP和cGMP：环状核苷酸（3’,5’)，作为细胞间信息传递的信使。5’5’3’3’一、核酸的一级结构：核苷酸的排列顺序。磷酸二酯键：一个核苷酸的C3’-OH与另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯键。第二节核酸的结构5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，表示时，必须注明方向。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH二、核酸的高级结构1.DNA的结构（1）DNA的一级结构脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列。通常碱基序列由DNA链的5′→3′方向书写。DNA的碱基序列本身就是遗传信息存储的分子形式。（2）DNA的二级结构——双螺旋结构模型1953年，Watson和Crick提出。①主链：•两条核苷酸链反向平行，沿同一中心轴平行盘绕形成双螺旋结构；•碱基位于双螺旋内侧，磷酸和脱氧核糖基位于外侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面平行于纵轴；•两条链均为右手螺旋，其磷酸二酯键的方向相反，即一条为5’→3’，另一条为3’→5’。双螺旋结构模型要点•②碱基配对：•A与T（2个氢键）、G与C（3个氢键）严格配对。•③碱基参数：每圈螺旋含有10个核苷酸，螺距3.4nm，双螺旋平均直径2nm。•④螺旋表面：碱基对占据的空间不对称，双螺旋表面形成两条螺旋形凹沟——大沟和小沟。（3）双螺旋结构的稳定因素①氢键：比较重要；②碱基堆积力（basestackingforce，是稳定DNA的主要因素；（疏水作用）③离子键：减少静电排斥。2.0nm小沟大沟结构特点1.碱基组成A、G、C、U（A＝U/G≡C），稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；配对不严格，除G-C还可以G-U；2.多为单链结构，少数局部形成螺旋，不能形成双螺旋的部分则形成突环，称为“发夹型”结构；3.分子较小。三、RNA的结构与功能主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TψC环含有T和ψ(假尿嘧啶）。tRNA的二级结构——三叶草结构模型第三节核酸的性质及纯度测定一、核酸的溶解性核苷酸、核苷、碱基的纯品都是白色粉末或结晶；DNA为疏松的石棉样的纤维状结晶。1.溶解性：DNA和RNA一般都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。2.0.14摩尔法——分离DNA蛋白和RNA蛋白方法DNA蛋白在0.14mol/LNaCl溶液中的溶解度最低；RNA蛋白在0.14mol/LNaCl溶液中的溶解度较大；可用于提取DNA蛋白和RNA蛋白。二、核酸的解离1.多价解离：磷酸基在生理条件下可解离形成多价阴离子，即多元酸；碱基具有碱性，故核酸为两性电解质，通常表现为酸性。由于磷酸酸性碱基的碱性。2.带电性：带电性使核酸、核苷酸可用阳离子交换树脂分离；DNA的等电点为4~4.5，RNA的等电点为2~2.5。由于RNA分子中2’-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。三、紫外吸收：核酸碱基具有共轭双键，有紫外吸收性质，吸收峰在240~290nm，测定时选用260nm。四、变性与复性引起变性的外部因素：加热、极端的pH条件、有机溶剂、尿素、甲酰胺等。DNA变性后的表现：分子由具有一定刚性变为无规则线团，DNA溶液的粘度降低，沉降速度加快；内部碱基全部暴露出来，A260nm增大，表现出增色效应。DNA的变性：受到某些理化因素的影响，分子中的氢键、碱基堆积力等被破坏，双螺旋结构解体，分子由双链变为单链的过程。一级结构不变。四、变性与复性DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度(meltingtemperature,Tm)。近似生理条件下，Tm一般在85~95℃。DNA变性退火变性00.10.20.30.4220240260280300波长/nm光吸收核酸变性时光吸收值显著增加（增色效应），但复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。核酸的复性（退火）：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。核酸的杂交：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。1.定磷法、定糖法——测定核酸含量（1）定磷法：纯核酸含磷元素量为9.5%左右。核酸含量=核酸磷含量×10.5测定范围：10~100g核酸。（2）定糖法：RNA或核苷酸→核糖→脱水形成糠醛→与3,5-二羟甲苯(苔黑酚)反应生成绿色物质（670~680nm）。DNA水解后，脱氧核糖在浓硫酸或冰醋酸存在下与二苯胺反应生成蓝色物质（595~620nm）。五、核酸的含量与纯度测定2.凝胶电泳——DNA纯度鉴定（1）紫外吸收法测定核酸纯度：纯DNA的A260/A280为1.8；纯RNA的A260/A280为2.0。纯化DNA时以1.8~2.0为纯度标准。（2）凝胶电泳法鉴定DNA纯度常用琼脂糖凝胶电泳。六、核酸碱基序列的测定1.DNA碱基顺序测定方法基本步骤：DNA片段的制备：借助限制性内切酶技术实现。DNA片段数量不足可采用PCR技术进行扩增。DNA碱基顺序测定：目前多采用Maxam-Gilbert的化学降解法Sanger法（末端终止法）OHOH2CHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤ddATPPPPSanger的酶法第四节核酸的生物合成与生物功能一、核酸与遗传信息的传递1.DNA是基本遗传物质有了一定结构的DNA，才能产生一定结构的蛋白质，根据DNA的特定遗传密码产生的蛋白质就代表特定生物的遗传性。在遗传过程中DNA的具体作用：（1）在细胞分裂时按照自己的结构精确复制传给后代（2）作为模板将所贮遗传信息传给mRNA。Reversetranscription分子生物学中心法则•复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。•转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。•翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。•逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。二、与DNA复制有关的酶和蛋白质•原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)•模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。•引物：一小段RNA(或DNA）为引物。•复制所需酶类：DNA聚合酶、DNA连接酶、旋转酶、解旋酶、引发酶、单链结合蛋白等。酶种类作用DNA聚合酶Ⅰ5’→3’聚合酶，且具有外切核酸酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5’→3’聚合酶，且具有3’→5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶Ⅲ与酶Ⅰ作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶replicase）1.DNA聚合酶（1）原核细胞DNA聚合酶•三种DNA聚合酶的功能：•DNA聚合酶Ⅲ：真正的DNA复制酶，在模板DNA上从引物开始的新DNA链聚合是由它催化的。•DNA聚合酶Ⅰ：填补引物去除后的空缺（修复功能）•DNA聚合酶Ⅱ：与DNA聚合酶Ⅰ一起行使作用或辅助聚合酶Ⅰ的功能。（2）真核细胞DNA聚合酶：至少五种，命名为、、、、。•与复制相关的