《临床生物化学检验》 诊断酶学分析

卫生部“十二五”规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材首都医科大学王培昌一、概述二、酶测定技术三、常用酶及同工酶测定的临床应用一、酶的概念与特征（一）酶的组成、结构与功能1.酶的本质和特征2.酶的结构和功能（二）酶的催化作用机制1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位2.酶反应的诱导契合学说（三）酶的命名1.习惯命名法2.系统命名法（四）酶的分类与编号第一节概述（一）酶的组成、结构与功能1.酶的本质和特征⑴酶的化学本质：绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体，极少数酶是核酸。⑵酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外，还具有极高的催化效率、高度的特异性（specificity）及催化作用的可调节性等特点。⑶由酶所催化的反应称为酶促反应。酶促反应过程中的几个概念：酶活性（activity）；底物（substrate）；产物（product）；激活剂（activator）；抑制剂（inhibitor）⑷核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸。2.酶的结构和功能⑴酶和一般蛋白质一样，具有一、二、三乃至四级结构。单体酶（monomericenzyme）寡聚酶（oligomericenzyme）多酶体系（multienzyme）多功能酶或串联酶（tandemenzyme）⑵单纯酶（simpleenzyme）：仅由氨基酸残基构成的酶。结合酶（conjugatedenzyme）：除含蛋白质外，还含有非蛋白部分（金属离子或小分子有机化合物），前者称为酶蛋白，后者称为辅因子。（二）酶的催化作用机制1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位酶分子中能和底物特异结合并将底物转化为产物的区域称为酶的活性中心（activecenter），酶活性中心是由空间上彼此靠近的化学基团组成的具有特定空间结构的区域。2.酶反应的诱导契合学说（inducedfithypothesis）在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-底物中间复合物（ES）。在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为诱导契合学说。（三）酶的命名1.习惯命名法根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源等进行命名。此法虽较简单，但缺乏系统性，易造成混乱。2.系统命名法国际酶学委员会于1961年提出了酶的系统命名法（又称EC命名法）。规定每一酶均有一个系统名称，它标明酶的底物与反应性质，底物名称之间以“︰”分隔开。（四）酶的分类与编号1.根据酶所催化反应类型可将酶分为六大类，即：氧化还原酶类（oxidoreductases）转移酶类（transferases）水解酶类（hydrolases）裂解酶类（或裂合酶类）（lyases）异构酶类（isomerases）合成酶类〔synthetases或连接酶类(ligases）〕2.国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号。数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。二、同工酶的概念与特征(一)同工酶的概念与特征同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。(二)同工酶分类与命名1.分类根据同工酶的来源和结构不同，从基因角度可将其分为：单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。2.命名至今尚无确切的方法，常以组织名称、亚基的数目和组成或发现地地名等命名。酶同工酶种类相关疾病CKCK-BB,CK-MB,CK-MM(CK1,CK2,CK3)心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤LDLD1,LD2,LD3,LD4,LD5心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤ALP肝，小肠，骨，胎盘，肾肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤ACP红细胞，前列腺，溶酶体前列腺癌、血液病、骨肿瘤γ-GTγ-GT1,γ-GT2,γ-GT3,γ-GT4肝癌、梗阻性黄疸AMYP-AMY(P1,P2,P3),S-AMY(S1,S2,S3,S4)急、慢性胰腺炎、腮腺炎ALTALTs,ALTm心梗、肝病ASTASTs,ASTm心梗、肝病GPGP-BB,GP-LL,GP-MM(GP1,GP2,GP3)心梗、脑损伤、肾病、肌病GSTGST1和GST2(GST-α),GST3(GST-μ),GST4和GST5(GST-π)肺癌、肝炎ALDALD-A,ALD-B,ALD-C肝癌、肝炎、神经细胞癌NAGNAG-A,NAG-B,NAG-I肝病、肾病人体中几种重要的同工酶三、工具酶（一）工具酶参与的指示反应（二）酶循环法（三）代谢物浓度的酶法测定技术1.终点法（1）直接法（2）酶偶联法2.动力学法(一)工具酶参与的指示反应通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用工具酶多为氧化还原酶类。在临床生化检验中，许多项目的测定均有工具酶参与，最常用的有两类分光光度法：一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（H2O2），再加氧化发色剂比色；另一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。(二)酶循环法酶循环法（enzymaticcyclingmethods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。目前临床上已应用于总胆汁酸的测定。为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为固相酶（或固定酶）（immobilizedenzymes）。（三）代谢物浓度的酶法测定技术1.终点法在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。(1)直接法：如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析.(2)酶偶联法：如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的，即为酶偶联法。代谢物酶促终点法测定的基本条件是：①待测物浓度[S]应远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速率V=Vmax[S]/Km，呈一级反应；②反应配方中所用酶量（V）应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。※终点法测定的实验设计中，主要应考虑以下问题：（1）工具酶的特异性：（2）Km大小要合适：（3）酶的用量（4）工具酶中的杂酶应低于允许限。（5）反应平衡点：（6）附加剂：应不抑制酶的活性2.动力学法根据米氏方程，当[S]Km，一般[S]/Km0.2，最好0.05，[S]+Km≈Km，此时呈一级反应，反应初速度v=k[S]。如果能准确测定反应的初速度（v），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。酶活性测定酶学测定方法酶质量测定固定时间法（fixedtimeassay）连续监测法（continuousmonitoringassay）第二节酶测定技术一、酶活性测定（一）定时法测定酶活性（二）连续监测法测定酶活性（三）干扰因素（四）血清酶活性浓度测定的条件的优化（五）部分分析前因素对酶活性测定的干扰（六）酶活性浓度的单位（七）系数K值的计算与应用（八）临床酶学测定的标准化(一)定时法测定酶活性定时法是根据固定时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶活性，这是早期测定酶活性浓度的方法。用定时法准确测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，避开延滞期和一级反应。定时法中可能引起的误差(二)连续监测法测定酶活性连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。1.直接法在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等计算出酶活性浓度。只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。2.间接法采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。(1)最简单的酶偶联反应（单底物反应且只有一个工具酶）模式为：Ex：被测定酶C：被检测物质Ei：指示酶Ex催化的反应称为始发反应，产生被检测物质产物C的反应称为指示反应。(2)如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：一般习惯将最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶称为辅助酶（Ea）。(3)偶联反应中存在几个时相：①预孵育期：反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应。②延滞期：加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物B开始出现并逐渐增加，但仍处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率Vx。③稳态期：产物B增加到一定程度时，Ex和Ei催化的反应速率相同，达到了稳态期。此阶段特定波长处（如340nm）吸光度才会有明显的线性变化。酶偶联法测定ALT的吸光度变化(4)指示酶的选择①Vx/(Km)x=Vi/(Km)iVi：指示酶的用量Vx：测定酶的测定上限(Km)x：分别是测定酶(Km)i：指示酶的米氏常数②米-曼氏方程在酶偶联反应中，指示酶催化反应速率Vi的计算公式为：式中Vx为测定酶的测定上限，(Km)i为指示酶的米氏常数，P为中间产物浓度。③McClure介绍的另一种近似计算法计算延滞期时所需指示酶的量。假定酶偶联反应如下：第一个反应为零级反应，第二个反应为一级反应。如测定时间很短，[C]浓度不高时，指示酶催化反应速率Vi可通过下列公式进行计算：式中t*表示延滞时间，(Km)i为指示酶的米氏常数，Fb是在t*时产物B为其稳态浓度的百分数，一般选用0.99。(三)干扰因素1.其他酶和物质的干扰2.酶的污染3.非酶反应4.分析容器的污染5.沉淀形成(四)血清酶活性浓度测定的条件的优化测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大。主要与下述一些因素有关：①如底物、辅因子、活化剂、缓冲液和变构剂种类和浓度；②指示酶和辅助酶的种类和浓度；③反应混合液的pH和离子强度；④其他可变因素，如已知抑制剂的去除。1.方法选择尽可能采用连续监测法；尽量减少操作步骤。2.仪器和设备明确规定仪器和设备的各种性能规范。3.试剂化学试剂必须具有一定纯度；试验用水最好是纯水或双蒸水。4.自动生化分析仪参数的设置（1）方法类型终点法或连续监测法。反应方向分正向/向上/+（吸光度增加）或负向/向下/-（吸光度减低）。（2）波长选择酶促反应体系吸光度最大的波长（3）样品量与试剂量应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。一般推荐样品与试剂体积比为1:10。（4）稀释水量（5）反应时间线性反应时间范围愈宽者，愈适于临床应用。（6）孵育时间（7）延迟时间（8）监测时间酶活性测定的连续监测法至少90~120s或至少4点（3个A），少于3个A不能称为连续监测法，因为不能计算线性度（不知是否为线性反应）。（9）试剂吸光度上、下限（10）底物耗尽限额（11）线性度（12）试剂空白速率（13）线性范围按试剂质量而设置，超过范围应增加样品量或稀释后重测。（14）计算因子F值（或系数K）(五)部分分析前因素对酶活性测定的干扰1.溶血部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外（如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、己糖激酶等），少量血细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。2.抗凝剂草酸盐、柠檬酸盐和EDTA等抗凝剂为金属