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一次性无菌医疗器械无菌检测培训上海市食品药品包装材料测试所2006.12.16微生物学的基本概念微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。有体积小，面积大（巨大的营养物吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的接受面）；生长旺，繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多的特点。微生物学的基本概念根据其不同的进化水平和形态上的明显差别可分为原核微生物﹑真核微生物和非细胞微生物。我们进行的无菌实验所检验的细菌与霉菌就分别属于原核微生物和真核微生物这两大类中。微生物学的基本概念所谓原核微生物与真核微生物最主要的区别就是,真核微生物的细胞核由双层的核膜包裹,其上有许多膜孔,核内有一核仁;而原核微生物的细胞核确切的说只能称为核质体,或称为拟核,其外无核膜包裹。细菌细菌属原核微生物，是一类细胞细而短（细胞直径约0.5um,长度约0.5-5um），结构简单，细胞壁坚韧，以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。最适生长pH值为7.0～8.0。细菌（菌落――指微生物单个细胞或一小堆同种细胞接种于固体培养基表面，在适宜的培养条件下，能迅速生产繁殖，形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见的，有一定形态构造的子细胞集团；菌苔――指将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果其长成的各“菌落”相互连接成一片，即为菌苔。）细菌专性好氧菌：绝大多数真菌和许多细菌（铜绿假单胞菌）兼性厌氧菌：许多酵母菌（大肠杆菌，产气肠杆菌）微好氧菌：（霍乱弧菌）耐氧菌：大多数乳酸菌（乳酸乳杆菌）厌氧菌：（梭菌属、双歧杆菌属及各种光合细菌和产甲烷菌）细菌若要观察细胞的细致形态和主要构造，一般都要对其进行染色。革兰氏染色法由丹麦医生C.Gram于1884年创立，固以其名命名。通过革兰氏染色法可将几乎所有的细菌都分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两个大类，是分类鉴定菌种时的重要指标。细菌革兰氏染色法的机制主要是：初染﹑媒染后，细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏阳性菌细胞壁厚，肽聚糖含量高，分子交联度紧密，且含脂类少，洗脱时，肽聚糖网孔脱水收缩，不能溢出，仍呈紫色。革兰氏阴性菌壁薄，肽聚糖含量低且松散，脂类含量又高，复合物易溶出，故呈无色，经复染后呈红色。细菌甲细菌紫色初染媒染脱色复染结晶紫碘液乙醇沙黄乙细菌红色霉菌霉菌属于真核微生物。是丝状真菌的一个通俗名称，意即“发霉的真菌”，通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。霉菌的细胞呈丝状，在固体培养基上的菌落形态较大，质地较疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状，绒毛状或棉絮状，菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。真菌酵母菌丝状真菌大型真菌(覃)细菌和霉菌主要特征比较形态比较细菌霉菌菌落含水状态很湿或较湿干燥外观形态小而突起或大而平坦大而疏松或大而致密细胞相互关系单个分散或有一定排列方式丝状交织形态特征小而均匀粗而分化细菌和霉菌参考特征比较形态比较细菌霉菌菌落透明度透明或稍透明不透明菌落与培养基结合程度不结合较牢固结合菌落颜色多样十分多样菌落正反面颜色的差别相同一般不同菌落边缘一般看不到细胞可见粗丝状细胞细胞生长速度一般很快一般较快气味一般有臭味往往有霉味微生物的生长周期延滞期指数期稳定期衰亡期AB代表延滞期BC代表指数期CD代表稳定期DE代表衰亡期020406080100120ABCDE时间数量微生物的营养和培养基六大营养元素碳源氮源能源生长因子无机盐水微生物的营养和培养基按外观的物理状态分固体培养基﹑半固体培养基﹑液体培养基。按用途可分基础培养基、增菌性培养基、选择性培养基、鉴别性培养基。消毒和灭菌方法灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。消毒：一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。菌种的保存琼脂斜面低温保藏法液体石蜡保存法沙土管保藏法（产孢子的微生物，干燥）麸皮保藏法滤纸保藏法液氮超低温保藏法冷冻真空干燥保藏法无菌检验原理消毒不完全的样品，均含有细菌或霉菌，将检查样品经过严密无菌操作方法接种到适宜的培养基内，然后将该混合物放在适宜的温度下，一定时间，假如样品中尚有活的微生物存在，微生物就能大量繁殖，培养基由澄清变混浊，利用此原理来测定样品是否确已无菌。无菌实验的基本常识无菌实验室的环境控制要求无菌实验人员的衣着要求无菌实验室的清洁、消毒进入无菌实验室的物料的消毒及灭菌被污染物料的消毒或微生物灭活阳性菌种的管理无菌实验过程（GB14233.2-2005）培养基的适用性检查：参照中国药典阳性对照菌：金黄色葡萄球菌菌液样品取用量：3~11个单位供试品无菌实验过程（GB14233.2-2005）试验方法：薄膜过滤法或直接接种法需气菌、厌气菌培养基：硫乙醇培养基霉菌培养基：改良马丁培养基试验方法：直接接种法接种量：参照中国药典无菌实验过程（GB14233.2-2005）培养周期：细菌14天霉菌14天结果判断中国药典2005年版无菌试验简介批产量每种培养基最少检验数量≤10010%获4件（取较大者）100＜N≤50010件＞5002%或20件（取较少者）中国药典2005年版无菌试验简介培养周期：好氧、厌氧菌及真菌的培养周期均为14天培养基要求方法验证试验试验环境要求实验结果的评价及报告2个标准的结果判断方式比较GB14233.2-93：初试长菌，复试2次，根据复试结果判定样品的合格与否。新版GB14233.2-2005:参照中国药典。中国药典：初试长菌，经判断试验有效，即判定样品不合格；若经判断试验无效，进行重试，根据重试结果对样品进行判定。实验结果的评价及报告记录是检验过程中产生的表面文件。完整，真实的记录不仅可以证明实验是符合规范质量要求的，而且还有其它的优点。良好的记录可以使操作人员知道自己已经干了些什么，下一步将要干什么。实验结果的评价及报告首先所使用的无菌室和培养基及其他设备合格或不合格的判断是根据记录作出的。无菌室检查记录、培养基、稀释剂等配制批记录及每天结果观察记录，记载了无菌室条件、批培养基配制及质量检查和观察结果的全部情况，使检验结果的调查与追溯成为可能。这一整套记录，可以了解某一次检查所涉及到的所有环节的情况。原始记录也是实验操作规范执行情况进行验收的最主要内容之一。实验结果的评价及报告培养基配制及灭菌记录仪器使用记录受控冰箱温度记录菌种记录（菌种台帐传代及确认实验记录）菌种销毁记录消毒记录无菌实验原始记录实验结果的评价及报告1样品名称、批号2检验依据3样品预处理4培养基批号5环境监控记录6实验现象记录7检验结果8检验人员、复核人员实验结果的评价及报告检验报告必须包括的内容有以下几点：1)样品名称2)样品批号3)检验依据4)检验结果5)结论6)检验日期7)检验人员