功能性降脂红曲的研究

功能性降脂红曲的研究（二）生产工艺与检测筛选方法发布时间:2009-01-05目前的药理学研究和临床试验证实红曲有效性功能成分MonacolinK能有效降低体内总胆固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，同时升高高密度脂蛋白水平，从而具有显著的降胆固醇及降血脂的作用。然而，真菌毒素桔霉素(Citrinin)的发现使功能性红曲的使用安全性受到了挑战。桔霉素是红曲菌的次生代谢产物，具有肾毒性，还可致畸、致癌和诱发基因突变等。桔霉素的存在已成为我国功能性红曲应用和出口的瓶颈。因此，采用新型生产工艺、优化发酵条件、应用菌种筛选等现代技术，研发富含降脂活性物质MonacolinK且不含桔霉素的功能性红曲势在必行。因此，生产工艺的优化成为研究者们研究的重点。一、提高MonacolinK产量的途径目前国内外主要通过以下几种途径来提高MonacolinK的含量：菌种诱变、对发酵条件进行优化、使用超声波处理技术、添加诱导剂等。1、菌种诱变为提高MonacolinK的含量，国内学者采用不同的物理、化学或复合方法对红曲霉菌株进行诱变以获得高产菌株，已经采用的诱变方法列举如下：①将原始菌种经微波及亚硝基胍联合诱变，多次选育后固态发酵，MonacolinK的含量可达35.6mg/kg；②采用Nd:YAC激光进行诱变处理，经液体发酵后MonacolinK产量为1.78mg/L，产量是原菌株的3.6倍；③利用紫外线和氯化锂诱变筛选产MonacolinK的红曲突变株，产量可提高3倍；④采用紫外线(UV)、硫酸乙酯(DES)、氯化锂(LiCl)等诱变剂对菌株进行反复诱变处理，获得高产菌株，其MonacolinK产量最高可达到原菌株的41倍。2、发酵条件优化①液态发酵条件的优化为提高红曲霉液态发酵产MonacolinK的含量，国内外学者做了大量的工作。国内学者主要考虑不同的碳源、氮源、无机盐、微量元素、接种量以及培养条件，多采用单次单因子法和响应面法相结合的方法对工艺条件进行优化，且多采用甘油为碳源，大豆为氮源，26℃下培养14-15d，有摇瓶发酵的MonacolinK含量可达到1600mg/L，15L小型发酵罐也可达888.9mg/L。国外学者则多采用响应面法对不同菌株产MonacolinK进行工艺条件优化。下面列举几个研究结果：培养基一，最大产率131mg/L：大米粉34.4g/L，蛋白胨10.8L，甘油26.4L，葡萄糖129.2g/L；培养基二，最大产率351mg/L：葡萄糖29.59L，NH4HCl3.86L，K2HPO41.73g/L，MgSO4·7H2O0.86g/L，MnSO4·H2O0.19g/L。②固态发酵条件的优化为提高红曲霉固态发酵产MonacolinK的含量，国内学者主要考察物料厚度、初始含水量、培养温度、发酵时间、初始pH值等发酵条件，并对其进行优化。最近研究发现不同的米质也会影响MonacolinK的产量，蛋白质和糖分含量高、C/N比小、垩白度适中、吸水性好并能保持湿度的大米基质上MonacolinK产量高，同时伴以适当摇瓶，可以提高培养基的通气性，也会使MonacolinK含量成倍增加。另外也有学者对发酵培养基的成分进行了优化，发现稻米的种类及米的粉碎度对MonacolinK的合成有一定的影响，以粳米为基础基质，向其中加入葡萄糖和有机氮源能显著提高发酵产物中MonacolinK含量，同时发现将多种蔬菜浸出汁加到基础基质中都能提高MonacolinK的含量。也有研究者为减少大米的消费量，以麦麸为基质发酵提取MonacolinK，但还有待于进一步地研究。3、使用超声波处理技术这种技术源于超声波对微生物有很强的生物影响，研究发现开始超声波处理的时间和超声波处理的时长都会影响MonacolinK的含量。在培养72h后，超声波处理2min时，MonacolinK的含量达到最高，相比初始菌株提高39.69%。4、添加诱导剂发酵生产过程中，通过添加诱导剂的方法提高目的产物的生物合成效率是一种非常有效的方法。有研究者向培养底物中添加0.3%的乙醇，可提高产率近4倍。二、MonacolinK的检测方法Monacolin的检测方法主要有三种：紫外分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱（HPLC）法，超临界流体色谱法等。其中最常用的是以C18柱为分离柱，采用乙腈或甲醇和磷酸水溶液为流动相，并用紫外检测器进行检测的HPLC分析方法。其中紫外分光光度法的灵敏度和准确度较差，最低检测量为40mg；薄层层析法比较简便灵敏，最低检出量为4.0mg；但是目前单向薄层层析法的分离效果不是很理想，HPLC法的灵敏度和准确度最好，最低检出量为0.4mg。红曲中的MonacolinK以两种形式同时存在，即闭环的内酯式结构和开环的酸式结构。随着红曲生产加工过程中干燥程度的逐渐增加，酸式结构的MonacolinK逐渐脱水向内酯式结构转化，因此，生产加工工艺不同，产品中两种结构成分的含量也不尽相同。目前，红曲中MonacolinK的HPLC检测方法多采用美国药典中土曲霉内酯式洛伐他汀的检测方法，事实上仅适用于检测红曲中的内酯式MonacolinK。有研究者将红曲样品碱化处理，使内酯式MonacolinK全部转化为酸式结构，再以HPLC法测定红曲中MonacolinK的总量。江南大学的许赣荣教授则将红曲样品的pH值控制在6-7之间，使两种结构的MonacolinK在测定过程中不互相转化，然后分别再测定红曲中内酯式和酸式MonacolinK的含量，该方法对于天然功能性红曲的鉴别和质量评价具有重要意义。目前，功能性红曲产品的质量参差不齐，仍未有国家标准可同时检测红曲中两种结构的MonacolinK的含量。华南理工大学与韩国大学和企业合作，首次实现了酸式和内脂式MonacolinK的检测特异性与同步性，并首次将检测灵敏度提高到绝对检测量30ng。该法适用于任何含莫奈呵啉K的样品的检测，特别适用于大批量经常性的定性或半定量检测MonacolinK。三、MonacolinK的快速筛选方法目前，MonacolinK的薄层层析、HPLC及RP-HPLC等检测方法虽然精确度高，但检测过程比较烦琐。而红曲霉发酵滤液中MonacolinK经紫外分光光度计测定时，在237nm处有一明显的紫外吸收高峰，在229nm和247nm处有一紫外吸收小峰。由此可判断红曲发酵液中是否含有MonacolinK，这有利于大量初筛产MonacolinK的菌株。有研究者发现在用薄层析法测定红曲霉代谢物中MonacolinK时，用发酵滤液粗提浓缩物、最终提取结晶点样，结果几乎一致。因此在诱变育种提高红曲霉产MonacolinK工作中，只要用发酵滤液的粗提浓缩物进行薄层层析定性或定量检测即可进行快速初筛。