胃肠肿瘤基因检测

中山大学附属第一医院病理科肖萍胃肠肿瘤的分子检测与诊断胃癌与HER2检测结直肠癌与EGFR、KRAS检测胃肠间质瘤与C-KIT检测内容提要胃癌与HER2检测胃癌概述胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，全世界恶性肿瘤的病死率中胃癌居第二位年龄：40-60岁；性别：男女比例约为3:1临床表现：症状：上腹隐痛、腹胀、食欲不振、恶心呕吐、呕血与黑便、贫血、体重下降体征：上腹部深压痛、肿块、左锁骨上淋巴结肿大胃癌病理表现早期胃癌•概念：局限于粘膜或粘膜下层，不论其有无淋巴结转移•肉眼分型：表浅型、隆起型、凹陷型进展期胃癌•概念：癌组织浸润到粘膜下层以下者•肉眼分型：隆起型、溃疡型、浸润型组织学类型:腺癌(管状-、乳头状-、粘液-等)胃癌治疗手术治疗仍然是根治胃癌的最有效方法，然而，仅有30-40％患者可能通过单纯的手术治疗而获得治愈大部分患者死于肿瘤的再发或远处转移寻求手术以外的途径治疗胃癌、预防其复发转移成为胃癌综合治疗的重点和热点晚期胃癌急需有效的治疗措施研究显示HER2阳性胃癌患者使用靶向药物赫赛汀有效HER：humanepidermalgrowthfactorreceptor，人类表皮生长因子受体HER2，又名c-erbB-2；原癌基因，位于17q21，编码跨膜糖蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性；通过参与信号传道通路的一系列活动影响细胞的增殖与分化。HER2信号传导至细胞核细胞核接合部酪氨酸激酶活性部分细胞浆细胞膜生长因子（配体）促进细胞分裂、增殖HER2受体跨膜二聚体的信号传导途径1=基因拷贝数2=mRNA转录3=细胞表面受体蛋白表达4=细胞外受体功能域释放A=HER2DNAB=HER2mRNAC=HER2receptorprotein正常扩增/过度表达细胞核细胞质细胞膜1234CBAHER2过度表达：正常状态的10-100倍HER2基因的致瘤机制：抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞的侵袭力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。研究表明：30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等HER2在胃癌中表现大约16%的进展期胃癌患者HER2检测呈阳性胃癌组织的HER2过表达与肿瘤侵犯程度高和预后差密切相关；因此对于胃癌病人都要检测HER2赫赛汀是一种针对HER2阳性的胃癌患者新的靶向药物。准确的HER2检测对判断胃癌患者接受赫赛汀治疗是否有效至关重要•关键步骤包括标本收集固定石蜡包埋切片脱蜡IHC/FISH检测胃癌HER2检测流程0FISH+–可接受赫赛汀治疗评分系统基于:HofmannM,etal.Histopathology2008;52:797–805.胃癌HER2检测流程1+2+3+免疫组化肿瘤标本标本收集•标本来源：手术或活检标本可用于HER2检测标本初步处理•立即(20–30分钟内)进行标本标记、切开、固定•避开出血和坏死组织标本固定•标本固定不合格是HER2检测结果错误最常见的原因•在最快的时间内固定标本(20分钟内)•固定时间–手术标本:6–48h(至少1h/mm组织)–活检标本:不长于24h(至少1h/mm组织)•固定液种类–10%中性福尔马林•新配制的福尔马林(定期更新)–其他试剂必须经过验证，以保证结果可靠–非福尔马林制剂可能会妨碍IHC和FISH检测的可靠性石蜡包埋•标本用梯度乙醇/二甲苯脱水，石蜡包埋•避免标本长时间置于融化的石蜡中，因为高温会减少抗原表位•切片前，石蜡包埋标本可长期存放–用新鲜的石蜡–石蜡包埋标本最小1cm2–以利于切片切片和脱蜡切片•理想的切片应该在进行HER2检测前的短时间内立即进行•切片应该在肿瘤最有代表性的部位进行，且应该有HE染色证实•切片厚度可能影响结果的解读，保证切片厚度为2–4μm•将切片置于玻片上，放置于室温下12–24h或60°C1h干燥脱蜡•标本用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化•确保脱蜡完全，残余石蜡会增加非特异性染色•概念：用标记的特异性抗体对组织切片标本中某种化学成分的分布和含量进行组织原位定性、定位或定量研究。•基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织内抗原，对其进行定位、定性及定量的检测免疫组化技术免疫组化步骤•对组织切片进行预处理•抗原修复：微波修复、热修复等•阻断内源性过氧化物酶：H2O2去离子水•滴加一抗•滴加二抗•应用DAB溶液显色、封片•结果观察胃腺癌HER2检测可见不完全细胞膜染色IHC阴性(0)不染色或10%的细胞膜染色IHC阴性(1+)10%的细胞膜淡染/勉强可见染色；或仅有部分膜染色IHC可疑(2+)10%的细胞轻到中度完整细胞膜或基侧细胞膜染色IHC阳性(3+)完整细胞膜或基侧细胞膜强染色，且具有如下两种情况之一•切除标本中，染色细胞比例10%•活检标本中，不管染色细胞比例多少(如10%)，具有聚集的强染色细胞克隆胃癌的HER2评分标准FISH技术介绍----------------------------------------------------------------------样本预处理探针、样本变性探针＋样本杂交杂交后洗涤结果观察五步完成实验操作观察荧光信号在染色体上的位置及数量可反映相应染色体的情况肠型印戒细胞型高度扩增无扩增胃癌组织中Her2表达具异质性FISH技术的特点操作简单检测快速结果易观察灵敏性和特异性高，结果可靠、重复性好可检测样本种类多空间定位精确结直肠癌与EGFR、KRAS检测定义：发生于结直肠粘膜上皮的恶性肿瘤流行病学：地域性：不同地区发病率有明显区别高发：北美、西欧、澳洲等；低发：日本、南美、非洲等年龄：国内以40~50岁为多，中位数为45左右，40岁以下者全部病例的1/3左右；高发国家大肠癌高发年龄为60~70岁好发部位：直肠、乙状结肠病理分型：同胃癌结直肠癌概况EGFR与KRAS•表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR），表达于正常上皮细胞表面，对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、浸润、预后差有关。•EGFR下游的信号转导通路主要有两条：–Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路–PI3K/Akt/mTOR通路•KRAS蛋白处于EGFR信号通路的下游。在正常生理情况下，EGFR信号通路被活化后，KRAS蛋白短暂激活，其后迅速失活，KRAS激活/失活效应是受控的。而KRAS基因突变时，可以导致EGRF信号通路持续激活，加速肿瘤细胞增殖。SchubbertSetal.,NatRevCancer2007;295-308EGFR与KRASSchubbertSetal.,NatRevCancer2007;295-308EGFR与KRASK-ras是EGFR通路下游重要的效应子。EGFR靶向治疗和K-ras突变相对立K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费K-ras野生型患者才有可能从这类药物治疗中获益在结直肠癌中，K-ras基因突变率为35%-45%，已成为EGFR单克隆抗体治疗结直肠癌的主要疗效预测标志物。NCCN指南明确指出所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态。提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。美国ASCO推荐把K-ras12、13号密码子突变检测作为结直肠癌患者接受EGFR单抗治疗的预测指标。EGFR、KRAS与结直肠癌K-RAS突变检测适用范围•结直肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者检测意义•辅助临床医生筛选出可受益于爱必妥（Erbitux，西妥昔单抗）和帕尼单抗（Panitumumab）等靶向药物的癌症患者。仅适用于无突变的K-RAS基因野生型患者，对K-RAS突变患者无效。•为患者个性化用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。•检测方法：PCR•基本原理：利用PCR法扩增目的基因片段进行测序•检测样本：肿瘤组织或其石蜡病理切片提取的DNAK-RAS突变检测K-RAS突变检测•K-RAS基因最常见的激活方式为点突变•集中在12、13密码子突变，且与临床、治疗及预后是密切相关。•其它的密码子是没有意义的胃肠间质瘤与C-kit检测胃肠间质瘤（GastrointestinalStromalTumor，GIST）胃肠间质瘤是一类特殊的、胃肠道最常见的间叶源性肿瘤。1998年之前一直被诊断为消化道平滑肌（肉）瘤或（恶性）神经鞘瘤。1998年之后，GIST的分子研究获得重大突破，发现大部分GIST表达c-kit基因蛋白产物CD117，c-kit基因获得有功能性突变，这是GIST的特征性表现。定义：原发于消化道，由突变的c-kit或PDGFRA基因驱动、表达c-kit蛋白（CD117），组织学上由梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞构成的间叶源性肿瘤。GIST：发病机制基因突变在大多数病例的恶性转化中发挥着重要作用•C-kit：70–85%•PDGFRA：5–8%约8-15%的病例未检测到KIT/PDGFRA突变（“野生型GIST”）GIST发病过程正常的C-KIT基因发生突变转录、翻译CD117异常增多调节并刺激细胞增殖、肿瘤生长KIT基因激活是GIST致病原因c-kit基因：原癌基因，编码产物（CD117）定位于细胞膜临床表现常常为无症状，偶然被发现症状/体征与肿瘤的位置和大小有关•腹部肿块(38%)，胃肠道出血(30%),腹部隐痛或不适(40%)•贫血、食欲减退，体重减轻，恶心，乏力•急性腹膜内出血或穿孔66.812.620.60%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%2010梭形混合型上皮样型梭形细胞型上皮样细胞型混合型病理表现－组织学表现组织学上GIST由梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞组成病理学表现－免疫组化GIST特征性表达CD117（90-95%）、DOG1（98%）DOG1（DiscoveredonGIST-1）是最近发现的一种在GIST中特异表达的细胞膜蛋白，由DOG1基因编码，是一种功能尚不明确的蛋白大多数表达CD34（70%）；局灶性表达SMA（40%）和S-100蛋白（5%）；通常不表达Desmin（2%）；Ki-67表达反映增殖指数。CD117DOG1GIST的病理诊断依据GIST的病理诊断必须依据组织学特点和免疫组织化学检测结果做出。免疫组化：CD117（阳性率95％）、DOG1（98%）、CD34（阳性率70％）、SMA（阳性率40％）、S-100（阳性率5％）和desmin（阳性率2％）对GIST的辅助诊断十分有用。组织学符合典型GIST、CD117或DOG1阳性的病例可做出GIST的诊断。组织学表现符合典型GIST,CD117、DOG-1阴性病例重新免疫组化检测CD117和DOG-1蛋白。交由专业分子生物学实验室检测C-kit或PDGFRA基因的突变。C-kit或PDGFRA基因检测到有意义的突变，则可诊断为GIST。检测基因突变的位点：6个C-kit基因第9、11、13和17号外显子PDGFRA基因第12和18号外显子由于大多数GIST（70%-85%）的基因突变发生在C-kit基因第11号外显子或第9号外显子，因此可优先检测这两个外显子。组织学表现符合典型GIST，CD117、DOG-1阴性，且无基因突变的病例的处理在排除胃肠道可能发生的其他肿瘤（如平滑肌肿瘤、神经源性肿瘤等）后也可做出GIST（野生型）的诊断。标本处理手术后标本的固定:所有的标本应该在离体后尽快的进行相应的保存和固定固定的意义：•使蛋白质、核酸等大分子在原位凝固沉淀•使细胞内各种酶灭活，防止细胞自溶•保证免疫组织化学及分子学检测的可靠性和准确性所有的组织学标本建议用10%的中性福尔马林固定，应该避