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狂犬病毒基础知识及疫苗生产工艺2016年04月目录狂犬病毒特点疫苗发展史生产工艺原代疫苗优缺点狂犬病病毒归属于弹状病毒科(Rhabdoviridae），病毒形态是一端平坦或略凹状，另一端为半原形，酷似子弹，故得名弹状病毒，病毒大小75*175nm经组织培养后，病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒。单链RNA病毒.狂犬病毒的特点狂犬病毒形状狂犬病病毒电镜照片狂犬病毒对外界的抵抗力很弱，对温度敏感，60℃30~60min，100℃2min即可灭活。病毒对阳光、紫外线敏感，各种常见的消毒剂如肥皂水、碘酒、3%来苏尔、75%酒精等均可使其灭活。抗生素对其却无灭活作用。狂犬病毒的特点狂犬病病毒最大的特点是对神经组织的嗜性远远大于其他组织。在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高。狂犬病毒的特点1、狂犬病毒形状为子弹形，一端为椭圆形，另一端平整。2、狂犬病毒具有嗜神经性，主要在中枢神经内繁殖。3、狂犬病毒最初进入伤口时，不进入血液循环，而是在被咬伤的肌肉组织中复制，然后侵入神经系统。4、狂犬病毒在神经轴中的移动速度约5~100mm/天，如一定范围内（10um-2cm）的轴突同时受感染，病毒移行速度甚至会更快。狂犬病毒的特点野生动物与家畜是狂犬病的传染源。人类狂犬病由狗、猫直接传染者占90%以上，其次为牛（主要是水牛）、猪、兔、马、驴骡以及野生动物。狂犬病毒的宿主动物通过神经进入分泌腺体：在唾液中排出病毒进入大脑细胞引起全脑炎在神经系统中向心性移动通过肌肉周围神经末梢进入神经系统病毒在伤口周围肌肉细胞中复制被动物咬伤而感染病毒狂犬病致病机理一般20–60天从暴露后数天到数年，差别非常大主要的影响因素感染的病毒数量感染的病毒株暴露的严重程度暴露的部位•一般20-60天•1月内发病71%•3月内发病87%7-10天10-20天21-28天1-3月3-6月6-12月1年3.25%41.87%25.88%16.12%3.25%3.25%6.38%潜伏期人用狂犬病疫苗发展史1882年，巴斯德成功在牛脑中分离到狂犬病毒株，并在兔脑内连续传90代，成为固定毒。1885年，巴斯德尝试研制减毒活疫苗1911年，Semple在巴斯德的研究基础上，研制出脑组织灭活疫苗；1956年，Peck研究制备鸭胚疫苗（DEV）。该疫苗在美国和其他国家用作狂犬病暴露后处理并广泛使用了27年，很少观察到严重的副作用，但中和性抗体水平不如脑组织疫苗。1964年，美国研制出人二倍体细胞疫苗，并于1978年开始商品化，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用。1984年由法国Merieun研究所研制成功Vero细胞疫苗国外疫苗发展史国内疫苗发展史1949年，羊脑组织疫苗1980年，原代地鼠肾细胞疫苗（淡苗）之后经历了浓缩苗、精致苗、无佐剂纯化苗90年代，引进Vero细胞疫苗2005年6月30日，无佐剂疫苗人用狂犬疫苗生产工艺解剖消化细胞制备对照细胞外源因子检查接种病毒aG病毒工作种子批鉴别试验病毒滴定无菌检查支原体检查病毒外源因子检查洗换多次收获病毒液、加液无菌检查病毒滴定支原体检查蛋白质含量病毒灭活病毒灭活验证试验无菌检查超滤蛋白质含量无菌检查纯化蛋白质含量抗原含量无菌检查半成品配制无菌检查分装目检包装入库销售鉴别试验外观装量化学检定效价测定细菌内毒素检查pH值硫柳汞含量游离甲醛含量热稳定性试验牛血清白蛋白残留量抗生素残留量地鼠肾细胞蛋白质残留量无菌检查异常毒性检查37±1℃.90-100h34±1℃.18-24h34±1℃.96-120h34±1℃.18-20h细菌内毒素检查地鼠肾细胞蛋白质残留量检测控制区B+A（灌装区）C+A（超滤、纯化区）C+A（病毒制备区）C+A(细胞制备区)渗透压摩尔浓度原始种子（3aG4）→豚鼠脑内传代（3aG5）→地鼠肾细胞传代（4aG）→豚鼠脑内传2代（4aG2）→建立主代毒种库主代毒种库（4aG2）→豚鼠脑内传1代（4aG3）→建立主工作毒种库毒种制备工艺：毒种制备工艺：地鼠→消毒、解剖、取肾、消化→细胞制备→接种病毒→洗换→收获病毒液→灭活病毒→超滤浓缩→纯化→半成品配制→洗瓶、灌装、轧盖→目检→包装→入库地鼠的挑拣清洗：纯化水4~6遍，注射用水3遍消毒：2%甲醛溶液2遍，0.1%新洁尔灭2遍解剖：扒皮、剪肌、取肾洗肾：消化：0.1%胰蛋白酶每对肾加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小时。解剖消化工艺地鼠消毒解剖地鼠培养液配制：Hanks’液＋营养液＋小牛血清＋硫酸庆大霉素细胞制备：弃去消化液，洗涤肾块，摇振分散细胞，反复收集数次。细胞培养：37±1℃培养90-100小时细胞制备工艺细胞培养地鼠肾细胞细胞观察毒种配制接种培养吸附：34±1℃培养吸附18-24小时接种病毒工艺维持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氢钠洗涤细胞换维持液病毒培养：34±1℃培养96～120小时洗换工艺细胞观察收获病毒液：收获标准加液：加维持液取样检定保存：收获液置2~8℃保存、待检；细胞瓶置34±1℃继续培养96～120小时多次收获病毒液、加液工艺收获液检查无菌转入加灭活剂：终浓度甲醛溶液250µg/ml灭活过程：灭活罐内混匀，于34℃±1℃恒温灭活18～20小时取样检定病毒灭活工艺采用截留分子量为300KD的滤膜超滤浓缩至蛋白质含量在2000～3000µg/ml范围内（浓缩倍数为50±10倍）按照病毒收获液体积的0.3～0.6倍的灭菌PBS对浓缩液进行分段洗滤超滤浓缩工艺浓缩液离心层析介质为琼脂糖凝胶Sepharose4FF纯化：以pH7.5的PBS洗脱，洗脱液流速240～280ml/分钟，280nm紫外检测,收集第一峰。取样检定纯化工艺配方计算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白质含量应不高于80µg/ml配制：将纯化后原液及终浓度为1%的人血白蛋白、40µg/ml的硫柳汞转入合并罐内混匀。取样配制工艺西林瓶清洗、灭菌：经超声波清洗后350℃5分钟干热灭菌分装：疫苗每支装量不少于标示量轧盖：通过传输带传至轧盖间，自动上机进行加盖封口。灌装工艺外观检查：双眼平视西林瓶，首先检查装量是否准确；再移至目检台黑、白色底板处检查是否有异物。目检工艺包装规格:小盒：5瓶/人份中盒：10人份/盒大箱：120人份/箱包装工艺1包材喷印按包装指令上内容对小盒、中盒、大箱、合格证进行调试印制，“产品批号”、“生产日期”及“有效期至”印制位置适中，字体应清晰。包装前核对对所有包材印制“产品批号”、“生产日期”及“有效期至”内容的核对应与包装指令内容一致无误。包装工艺2装盒：将计数后西林瓶逐一进行标签印制贴附；取5只贴签后西林瓶装入白色盒托，上放一份说明书装入小盒，贴上封口签；取10小盒装入一中盒，贴上封口签；取12中盒装入一大箱。最后放一张产品合格证进行封箱捆扎转入2～8℃冷库整齐摆放。包装工艺3电子监管码生成及贴附对10小盒产品进行一级电子条码扫描生成一个二级条码贴附在对应的中盒包装指定位置；对12中盒产品进行二级电子条码扫描生成两个三级条码贴附在对应的大箱包装指定位置。包装工艺41、外观：依法进行检查，结果为无色澄明液体，无异物。2、装量：依法进行装量检查，应不低于标示量1.0ml/剂。3、化学检定（1）pH值：依法进行检测，pH值应为7.2～8.0。（2）硫柳汞含量：依法进行硫柳汞含量检测，结果应为30～50µg/ml。（3）游离甲醛含量：依法进行游离甲醛含量检测，结果不得高于40µg/ml。成品检定4、效价测定：依法检查，放行标准应不低于4.0IU/剂。有效期内标准应不低于2.5IU/剂。5、热稳定性试验：疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37℃放置14天后依法进行效价测定，应不低于2.5IU/剂。6、牛血清白蛋白残留量测定：依法进行牛血清白蛋白残留量测定，结果应不高于50ng/剂。成品检定成品检定7、抗生素残留量测定：依法进行硫酸庆大霉素残留量测定，结果应不高于50ng/剂。8、地鼠肾细胞蛋白质残留量测定：依法进行地鼠肾细胞蛋白质残留量测定，结果应不高于24µg/剂。9、无菌检查：依法进行无菌检查，结果应符合规定。成品检定10、异常毒性试验：依法进行异常毒性试验检查，结果应符合规定。11、细菌内毒素检查：依法进行细菌内毒素检查，结果应不高于25EU/剂12、渗透压摩尔浓度：结果应符合规定原代细胞疫苗优缺点优点：不必冷冻保存细胞种子；原代细胞无DNA残留，不会产生致瘤性，安全性高；中和抗体产生较早副反应低缺点：生产成本高洁净区面积大产量低