影响毕赤酵母表达系统的因素

影响毕赤酵母表达系统的因素1影响毕赤酵母表达系统的因素烟雨莫问摘要:巴斯德毕赤酵母(Pichiapatoris)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成包涵体、背景蛋白多、表达量不很高等缺陷；弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂，表达水平低，生产造价昂贵的不足，还具有其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。但是酵母为高好氧微生物，在发酵过程中常常会出现供氧不足而限制了细胞密度的情况。关键词:毕赤酵母分泌表达微生物载体构建表达系统一、重组蛋白表达系统比较随着基因工程技术的发展，大量重组蛋白得到了有效地外源表达。目前主要的重组蛋白表达系统有:大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等表达体系[1]。相比之下(表1)，各种表达系统各有优缺点:表1各种表达体系特征比较表达体系优缺点产量原核体系大肠杆菌具有良好的可操作性,成本低,但不能进行糖基化修饰,胞内形成包涵体外源蛋白10%～70%胞内表达,0.3%～4%胞外表达真核体系酵母兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力,但存在产量低及过度糖基化等问题外源蛋白约占菌体总蛋白的10%甲醇营养型酵母第二代酵母表达系统,部分克服了过度糖基化缺点,有较好分泌性,产量较高,但产物结构与天然分子仍有一些差异。外源蛋白占菌体总蛋白的10～30%昆虫细胞具有高等真核生物表达系统的优点,产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似,表达水平较高,但糖基化程度较低,形式单一。外源蛋白占菌体总蛋白的1～500mg/L哺乳动物细胞系统产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近,糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。发酵液中表达产物含量为0.2～200mg/L使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低；但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低[2]。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，影响毕赤酵母表达系统的因素2但表达量低，操作繁琐，而且成本非常昂贵[3]。由于不同的表达系统在表达量、蛋白表达周期、蛋白折叠和加工能力、蛋白翻译后修饰如糖基化修饰和经济成本等方面存在差异，因此需要根据不同的重组蛋白特点以及不同应用目的来选择合适的表达系统。二、酵母表达系统2.1毕赤酵母表达系统概述现在已经建立和发展了多种酵母表达菌株，这些酵母各有特点，自1981年Hitzeman等用成功地表达了人干扰素以来，S.c表达了大量的外源蛋白，目前仍在在制药业中广泛应用。但具有一定的局限性，如难于高密度培养，缺乏强有力的启动子，分泌效率低，很难分泌分子量大于30kDa的外源蛋白质，而且富含甘露糖型的超高糖基化，表达蛋白质的C末端经常被截短[3]。人们在研究过程中发现一种更好的表达系统——毕赤酵母表达系统，目前该表达系统被广泛应用，此系统不仅具有高稳定、高表达、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)具有高密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为单一C源的酵母，主要有H.Polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三种。其中P.Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛，己被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越收到人们的重视。毕赤酵母表达系统已基本成为非常完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子A0X1，已高效表达了多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模。2009年来自该系统的KALBITOR已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。2.2毕赤酵母的优势毕赤酵母系统的成功应用，缘于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点:(1)含有AOX启动子，这是目前启动能力最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；(2)表达量高，既可以胞内表达，又可以分泌表达。绝大多数外源基因比在原核细胞、酿酒酵母、真核细胞中表达量高。一般毕赤酵母中外源基因都带有分泌信号肽，使外源目的蛋白分泌到培养液中，方便纯化；(3)发酵工艺成熟，适合高密度发酵。己经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上[10]，表达重组蛋白时，已成功放大到80，000升；(4)使用基础盐培养基。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖影响毕赤酵母表达系统的因素3及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；(5)遗传性状稳定。一般外源基因整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，随着染色体的复制而复制，不易丢失；而且遗传背景清楚，便于遗传操作。(6)作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰的功能。2．3毕赤酵母存在的问题与解决方案与其他表达系统一样，毕赤酵母也存在一些问题，特别是表达量低和一些失败的例子也在不断出现，通过阅读文献，汇总如下问题以及解决办法：(1)蛋白酶对产物的降解:毕赤酵母表达系统其最明显的一个缺陷就是分泌表达的蛋白在培养中可以被自身分泌的蛋白酶降解。由于毕赤酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会显著增多，外源蛋白也就易受到蛋白酶的作用而降解[11]。大量的相关研究已用于解决这个问题[13]。(2)特殊的外源蛋白的不能分泌:在实际应用过程中一些基因并没有表达出可以检测到的目的蛋白，如HIV表面糖蛋白[12]。原因可能是因为酵母自身的转录终止导致mRNA被切断。这一问题在富含AT的破伤风毒素基因被描述，可以通过全基因合成人为增加GC的含量而得以改善[13]。(3)甲醇的潜在问题:毕赤酵母不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，而且大量甲醇的堆放成为潜在风险源。可以通过更换表达启动子或者表达菌的甲醇利用型来解决这个问题[2]。(4)发酵周期相对较长:发酵虽然能达到非常高的菌体密度，但是发酵周期一般相对原核细胞明显较长，容易被污染，且长时间的发酵也不利于外源蛋白的累积。目前有许多不同的发酵策略可以选用，一定程度上缓解了该问题[2]。(5)高度甘露糖型糖基化:酵母表达系统的一个突出的缺点就是虽然能对产物进行糖基化，但糖基化的方式是高甘露糖型，与哺乳动物细胞不同[14]。针对这个问题，可以采取突变N-糖基化位点，或者对宿主菌进行糖基化工程改造[4]三、毕赤酵母表达系统的载体、菌株和转化机制在过去的研究和应用中，毕赤酵母表达系统已成为目前应用最为广泛的酵母表达系统，也成为重组蛋白研究和商业化生产的重要表达系统之一。下面将详细讨论外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响因素。3．1毕赤酵母表达菌株的选择目前所使用的各种巴斯德毕赤酵母菌株均来自于原始的Y-11430菌，而各菌株的差异主要表现在基因型的差异上，其中包括野生型、营养缺陷和蛋白酶缺陷。常用的毕赤酵母宿主菌基因型和表型如表2所示，其中GS115，KM71和SMD1168含有HIS4基因突变而不能合成组氨酸，部分表达载体中含有HIS4基因作为筛选标记，转化子可影响毕赤酵母表达系统的因素4以在组氨酸缺陷型培养基中生长。另外GS115，X33，和SMD系列菌株含有野生型的A0X1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的，转化子通常产生Mut+甲醇利用表型；而KM71和KM71H的A0X1由于基因突变，不能正常的代谢甲醇，甲醇氧化酶A0X2开始负责代谢甲醇，但是这个酶的启动子非常弱，该酶A0X2的表达量较低，甲醇利用速度较慢，转化子通常产生Muts表型。Mut+甲醇利用表型的转化子可以快速代谢甲醇，因此在甲醇培养基中可以快速生长，诱导表达时需要消耗大量甲醇，而Muts表型转化子代谢甲醇能力很弱，诱导表达时需要的甲醇量很少。因此他们各有缺点，尽管多数人倾向于使用Muts菌株，但是有时候Muts菌株也可能获得更髙的表达水平。SMD系列菌株是胞外蛋白水解酶缺陷型菌株，在使用非复合培养基时通常可以降低分泌蛋白产物的降解[2]。表2常用酵母的基因型和表型株系基因型表型应用范围GS115His4Mut+适用于含有his4的表达载体X33WildtypeMut+适用于Zeocin抗性表达载体KM71his4,aoxl,arg4Mut+适用于含有his4的表达载体KM71Haoxl,ARG4,arg4Mut+适用于Zeocin抗性表达载体SMD1165（H）His4，pep4Mut+胞外蛋白酶A活性缺失3．2表达载体的选择目前可用于酵母表达系统的商业化表达载体有十几种[7]。这些载体的主要区别在于:(1)是否含有信号肽，含有哪种信号肽；(2)是否含有营养缺陷型的基因，含有哪种营养缺陷型的基因；(3)是否含有抗性基因，含有哪些抗性基因；(4)含有哪些启动子；下面就几种常用的载体介绍一下这些载体中重要元件。可根据毕赤酵母表达图谱进行选择。不同的表达载体在信号肽、营养缺陷型和抗性基因上有所差异，应该根据实际应用进行选择。3．2．1信号肽对于一些在多克隆位点之前含有信号肽的载体如PPIC9K，往往用于胞外表达；对于不含信号肽的载体如PA0815，则用于胞内表达，或者用于含外源基因自身信号肽的胞外表达。酵母信号肽中最常用信号肽就是a交配因子前导肽。此外，常用信号肽还有酸性磷酸酶信号肽PHO、invertase信号肽SUC2等。对于有些蛋白，为了避免过度的糖基化修饰，这可采用胞内表达的策略，这时不需要任何信号肽。3.2.2营养缺陷型早期Invitrogen推出的商业化载体，含有正常的组氨酸脱氧酶基因(HIS4)，因此常常影响毕赤酵母表达系统的因素5在转化his4菌株中作为筛选标志。此外，最新推出的PichiaPink表达系统则是ADE2基因缺陷。3.2.3抗性基因为了简单快速获得高表达的转化子，往往还要进行目的基因高拷贝克隆的筛选，因此就需要在这些载体上引入抗性基因，如抗G418(kanamycin)的基因，后来就有了PPIC9K表达载体，这样就可以通过提高G418的浓度，来筛选高拷贝的表达克隆。然而，事实并没有那么完美，一些问题随之而来。首先，由于这些载体比较大(9。0kb-9。3kb)，因此体外克隆Fig.1VectordiagramsofpHIL-D2andpPIC9（图片来源：PichiaExpressionKitVersionM01110225-0043）相对困难，而且转化宿主菌后遗传稳定性差；其次，并不是所有的应用都需要特定勒点的基因取代，因此载体中3'AOX序列往往不需要；事实上，由于HIS基因本身较大，而且不参与高拷贝筛选，因此往往需要引入新的抗性基因，这样进一步加大载体。后来大量的研究工作用来寻找新的筛选标记，以减小载体并能实现高拷贝筛选，最终发现了Shble基因产物可以耐受zeocin抗生素，进而开发出pPICZ系列的表达载体(图1。2)。这些zeocin抗性的载体只有5'A0X的启动子序列、A0X1转录终止序列以及Shble基因序列。尽管这些载体不能直接进行AOXl的基因取代，但是可以通过对zeocin的超高抗性筛选具有高拷贝表达盒的转化子。如果转化时基因取代发生在A0X1基因上，那么这个基因会被破坏，进而产生甲醇利用慢型(Muf)的克隆。在这些zeocin抗性的载体中，表达盒可被单一位点的及m/n和Bg!U从载体中切下，这样便于进行体外高拷贝的构建，PA0815也可实现这个功能，但是由于PA0815载体较大(7。7kb)'因此克隆较难且转化子遗传学稳定性差。这种多