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开题报告姓名：廖聪颖学号：20065784班级：生物工程06-1班指导教师：罗水忠一、学位论文题目米根霉耐酸突变株的发酵条件优化及发酵特性二、所选课题的来源、目的意义及该课题在国内外研究概况(一)来源、目的意义乳酸，又名基丙酸(2-hydrxy-propionixcid)，是一种简单的α-羟基丙酸，广泛存在于人体、动植物及微生物体内。乳酸按其旋光性可分为L(+)一乳酸，D(一)一乳酸和DL一乳酸3种[1]。乳酸及其盐类和醋类广泛应用于食品、医药、农业和化工等行业。由于人体内只有代谢L一乳酸的酶，从而只能分解自身产生的或摄人的L一乳酸，世界卫生组织建议限制使用D一乳酸含量高的产品，D一乳酸或DL一乳酸不应加人到3个月以下婴儿的食品中，因此在用于食品及医药工业时必然要用L一乳酸代替DL一乳酸。自然界中可产生L一乳酸的微生物很多，工业生产上用得最多的是根霉菌属和乳杆菌属。而米根霉营养简单，产酸能力高，光学异构纯度高，而成为国内外生产L一乳酸普遍采用的菌种。由于L一乳酸是生产聚L一乳酸的原料而倍受科学家的重视，聚L一乳酸可望在将来代替PVC,PP等各种不可生物降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机。另外，由于聚L一乳酸良好的生物相容性，因此广泛用作医用材料，如药物缓释材料、组织工程材料、手术缝合线、骨折固定件等，被认为是最有发展前途的可生物降解的高分子材料，备受国内外关注。（二）国内外研究现状利用根霉发酵生产L一乳酸，其基本原理是米根霉能生产淀粉酶和糖化酶，它能利用糖，也可以利用淀粉或淀粉质原料生成L一乳酸。按微生物发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸(Hommofermentation)、异型乳酸发酵(Heteroferfentation)和混合酸发酵(Mixedacidfermentation)，传统意义上的同型乳酸发酵或异型乳酸发酵是针对乳酸细菌而言，米根霉作为好氧真菌，是依靠呼吸产能并提供合成菌体的中间产物，就发酵产物而言，其发酵类型属混合酸发酵，它经由EMP途径生成丙酮酸，然后进入三羧酸循环，米根霉能将大部分糖转化为乳酸，但同时也有乙醇、富马酸、唬拍酸、苹果酸等其他产物。目前，内外关于米根霉研究主要集中在以下几方面:1.1菌种选育菌种的优良直接关系到发酵过程的控制及其产量等，是发酵过程中的一个至关重要的影响因素。目前以米根霉为亲本的优良菌株的选育有:（1）高产菌株的筛选:白冬梅等人[5l利用酸性馒头片富集培养，用含脱氧胆酸钠和澳甲酚绿平板检出的方法，从土壤中选出了根霉菌R.oryzae3017。同时利用UV、硫酸二乙酷对菌株R.oryzae3017进行了诱变选育，得到突变株R.1021[6]。而离子注人生体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明，已经证实离子注人诱变，可以获得高突变率，扩大突变谱，为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间;同时，离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。（2）利用基因工程技术得到高产的目的工程菌株。L一乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)以烟酞胺腺嗦吟二核核苷酸NAD+/NADH作酶，可逆催化氧化L-乳酸生成丙酮酸，因此可以提高L一乳酸脱氢酶表达基因在菌株中的扩增，使其向有利于L一乳酸生成的方向进行。首次将米根霉的乳酸脱氢酶基因在酵母菌中表达。其后又通过提高乳酸脱氢酶活性来提高米根霉的产酸能力，其中带有较长基因片断的质粒明显比带较短基因片断质粒的产酸量高。1.2发酵工艺乳酸的发酵是起步较早、发展较成熟的一种有机酸发酵工艺。近几年对根霉发酵生产以L-乳酸的发酵工艺研究主要集中在发酵原料的选择、发酵条件的优化和菌丝形态等方面研究较多。米根霉可以利用的原料有玉米、淀粉、大米甚至玉米芯和工农业废物等。米根霉也像其它丝状真菌属微生物一样，表现出复杂的生长形态，主要有菌丝、菌球和大块聚集物。其生长形态主要受以下因素的影响:菌种本身的特性、营养供应情况、培养基的pH值、搅拌、通气、接种量和基质浓度等，以米根霉R1021为菌株，研究表明菌丝呈菌球状比块状产酸率高;发酵8h后添加CaCO3，可以得到均匀的菌球(直径1.0-2.0mm);当抱子密度在3x106个/mL时，菌球较均匀。Du等人通过控制CaCO3的添加时间使米根霉呈直径为1-2mm的小球体形态。目前，在米根霉发酵生产L(+)一乳酸的研究中，通过控制菌体形态使之自聚成为一定大小的球体进行乳酸发酵，因其操作简单、费用低而成为研究热点。三、课题研究的主要内容及拟解决的问题(一)主要研究内容如何对米根霉耐酸突变株进行发酵条件优化，以碳源，氮源，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锌为因素，每个因素选择不同浓度的5个水平，以产酸率和发酵转化率为考核指标进行正交试验，以乳酸产量高低为指标对实验结果进行考核，选出最优的培养基组成方案。同时对发酵特性进行研究，测定生物量，葡萄糖消耗速率，乳酸产率，酶活等，在最优发酵条件下研究发酵特性（二）拟解决的问题影响菌体形态的因素较多，各研究者只是研究了单一因素对菌体生长形态和产酸的影响，关键是各种因素对菌体形态的协同影响还未进行过研究。本实验将研究对各因素进行正交试验研究，优化发酵条件。（三）研究方法及具体方案1.1发酵条件优化1.1.1液体种子增殖培养在装液量为250ml的三角瓶中装入培养液,灭菌，接入孢子悬液，在摇床上振荡培养1.1.2摇瓶发酵在装液量为100ml的三角瓶中装入发酵培养液,灭菌,接种,在摇床上37摄氏度条件下培养1.1.3发酵培养基的正交试验优化：以碳源，氮源，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锌为因素，每个因素选择5个水平，以产酸率和发酵转化率为考核指标进行正交试验，用EDTA定钙法测定乳酸产量，并用高效液相色谱进行乳酸产量验证实验.1.2发酵特性研究以生物量，葡萄糖消耗速率，乳酸产量、产率，乳酸脱氢酶、ATP酶、乙醇脱氢酶的酶活为研究对象，进行发酵特性研究1.2.1生物量测定生物量以测菌体干重法进行测定1.2.2葡萄糖消耗速率用DNS法测葡萄糖残糖含量，从而从残糖含量得出葡萄糖消耗量1.2.3乳酸产量、产率用EDTA定钙法测定乳酸产量，并用高效液相色谱进行乳酸产量验证实验.1.2.4酶活测定将用各种试剂盒测定酶活五、实验主要设备、仪器、材料1.1.1菌种本实验室筛出的，由NTG诱变得到的米根霉耐酸突变株tu-1和由Co60γ诱变得到耐酸突变株tu-B。1.1.2培养基（1）菌种保藏斜面培养基：PDA培养基（2）种子增殖培养基（g/l）：葡萄糖：120g／L、（NH4)2S044g／L、KH2P040.3g／L、ZnS040.44g／L、MgSO40．025g／L（3）根据正交确定发酵培养基成分六、参考文献[1]金其荣，张继民。徐勤．有机酸发酵T艺学[M]北京：中国轻工业出版社。1989．[2]TmNDATrA．HydroxyeadⅪxylicacids[J]．EncyclopediaofChemicaltechonogy。1995，13：1042一l062．[3]本昌，徐建林，匡群．L_乳酸研究综述[J]食品与发酵工业，1993(3)56—61．PEIMINYIN，NAOKINISHINA．YUUKOKOSAKAI。eta1．EnheneeproductionofL(+)2lacticacidfromcornstarchinacultureofBhizopusoryzaeusinganair21iftBioreactor[J]．JFermentbioeng。1997。84：249—253．[5]YURC，HANGYD．KineticsofdirectfermentationofagriculturalcommoditiestoL(+)2lacticacidbyPdaizopuaoryz∞[I]．Bioteclmollett。1989。11(8)：597—600．[6]SUNTORNSUKW，HANGYD．StrainimprovementofBhizopusoryzaeforproductionofL(+)-lacticacidandglucoamylase．[J]．LettApplMitre,1994，19：249—252．[7]杨虹，林宇野，史美榕．L一乳酸生产菌的选育[J]．福州大学学报(自然科学版)。1994，22(2)：103—106．[8]杨虹,林宇野。史美榕．L一乳酸生产菌的选育[J]．微生物学通报。1994。21(6)：339—342．[9]天津轻工业学院，无锡轻工业学院，大连轻工业学院等合编．工业发酵分析[M]．北京：轻工业出版社，19921．