基因工程+(gene+engineering)

主要内容1.基因工程原理2.基因工程的基本内容3.基因工程的应用1、基因工程原理●理论上的三大发现（1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA（2）20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机理（3）20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式●技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶（2）基因工程的载体（3）逆转录酶的发现限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶Ⅱ型酶（用途最广）1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。特点：1.在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂;2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的;3.因此，断裂形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。限制酶（Ⅱ型）特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;限制酶切出的末端粘性末端（stickyend）:两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双两结构，所以称为粘性末端。平末端（bluntend）:在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。限制性内切酶能识别特定的碱基序列限制性核酸内切酶限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ-OH与另一条链的5ˊ-PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊT4DNA连接酶3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子的操作过程载体（Vector）载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA。常用的载体分为3类：质粒、噬菌体和病毒作为载体的条件能独立复制具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段。表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。载体有好几种，常用的有：1.质粒（plasmid）－是存在于细菌染色体外的、能自主复制的环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。2.噬菌体DNA－－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。用质粒构建重组DNA分子逆转录酶（reversetranscriptase）特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。基因工程的基本内容基因工程：又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在微观领域(分子水平)中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。又称为基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。克隆（cloning）：指无性繁殖系，即由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。基因工程的主要步骤1.从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段------目的基因的获得。2.将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子------DNA分子重组。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内------导入。4.筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆----分子克隆。5.克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质----基因表达。1.目的基因的获得获得目的基因的方法：直接分离法化学方法合成从构建的基因文库中钓取PCR法逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接分离法：鸟枪法（散弹射击法）shotgunapproach将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。优点:是操作简便，缺点:是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中.化学合成：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为基因文库。文库中基因总数就人来说约有5－10万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。获得目的基因基因文库构建流程图基因组文库的制备步骤：1.纯化全细胞DNA；2.部分限制性酶切得到适当大小的片段；3.插入到合适的载体上；4.转化受体菌，获得含不同DNA片段的克隆群。印迹法的主要步骤：（1）基因文库－DNA用限制性内切酶处理。（2）DNA片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。探针DNA片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15－20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，即为探针DNA片断。多聚酶链式反应/聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize聚合酶链式反应:利用酶促反应在体外大量、特异性扩增DNA片段。把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。threesteps:HowPCRworksDenaturation(变性):90～97℃Annealing(退火):45～55℃Extension(延伸):around72℃PCR反应分三步完成：第一步——900C高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。第二步——500C温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步——700C温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。900C500C700CPCR操作流程聚合酶链式反应1.Denaturation2.Annealing3.Extension5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA5555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。Cycle35555555555555555PCR的三个步骤为一次循环，约需5－10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增106倍，总共只需几个小时。逆转录法获得真核目的基因•分离纯化目的基因的mRNA•逆转录成单链DNA•经DNA聚合酶作用产生双链DNA获得目的基因方法Ⅰ：①合成cDNA第一链5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA3’mRNATTTTTTT5’cDNA1Oligo(dT)，反转录酶dNTP,②合成cDNA第二链~~~~~~~~~AAAAAA3’cDNA2TTTTTTT5’RNaseH，DNA聚合酶,dNTP5’AAAAAA3’双链cDNA3’TTTTTTT5’2.基因的重组构建重组质粒3.外援DNA片断导入受体细胞受体细胞有多种，原核细胞、低等真核细胞生物的细胞如酵母、植物细胞、哺乳动物细胞等。胰岛素基因工程生产就是将外源DNA导入原核细胞大肠杆菌中进行表达实现的。3.外援DNA片断导入受体细胞构建好的重组DNA分子进入寄主细胞的过程，称为转化。如果接受异源DNA的细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细胞，常常称为转染。4.选择目的基因1.目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛选，才能确定真正所需要的目的基因。2.首先需要制备探针（probes）。探针是根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记。鉴定带有目的基因的克隆的方法用标记的DNA探针与DNA杂交用抗体对蛋白质产物进行免疫杂交对蛋白质的活性进行鉴定标记的DNA探针用抗体对蛋白质产物进行免疫杂交5.基因的表达克隆基因表达的三个条件：基因的编码区不能被插入序列所中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶所降解.小结基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入受体；4、选择目的基因；5、目的基因的表达基因工程的操作流程基因工程的应用基因工程药物制备疫苗基因治疗转基因动物转基因植物工程菌生产基因工程产品的生物反应器1、基因工程药物生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因用DNA重组的方法连接在体载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及作成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的2－3万美元/病人200－300美元/病人基因工程生产胰岛素的原理（示意图）2、制备基因工程疫苗基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。常见的基因工程药物1.干扰素系列，肝炎病毒复制抑制、肿瘤治疗2.白细胞介素系列肿瘤、免疫增强3.EPO（促红细胞生成素）促进红血球增生、治疗贫血4.G-CSF促进粒细胞增生5.TPO促进血小板生长6.EGF促进表皮细胞生长7.NGF促进神经细胞生长8.单克隆抗体系列9.基因工程疫苗3、转基因动物•提高动物生长速度•改善畜产品的品质•用转基因动物生产药物•用转基因动物作器官移植的供体•比较：普通鲤鱼和转生长激素基因鲤鱼•比较：混有激素的饲料饲养鲤鱼导入生长激素基因的转基因鲤鱼改良物种特性动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因↓把YFG放在β—乳球