基因工程

1.1DNA重组技术的基本工具资料分析：位于费城托马斯·杰斐逊大学的希拉里和她的同事成功地将人体狂犬病抗体的DNA译码移入烟草作物中。转基因烟草作物可以产生一种人体蛋白质，而这种物质能抗击致命性的狂犬病病毒。导入：DNA重组技术的基本工具•准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性核酸内切酶•DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶•基因转移工具（“分子运输车”）——基因进入受体细胞的载体思考分组讨论•原核生物为什么没有在长期的进化过程中由于外源DNA的入侵而灭绝，有什么保护机制？限制性内切酶从哪里寻找？1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的作用特点：1.能识别特定核苷酸序列；2.从特定部位的两个核苷酸之间切开。限制性内切酶限制酶黏性末端和平末端限制酶所识别的序列有什么特点•限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。分组讨论：2.基因的针线──DNA连接酶切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？阅读思考：DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链双链单链连接部位在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键阅读总结限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，也有两种酶。黏性末端平末端3.基因进入受体细胞的载体常用的运载体：质粒、噬菌体和动、植物病毒等载体必须具备的条件如果载体对受体细胞有害将怎样？目的基因是否进入受体细胞，没有标记基因我们能否鉴定？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？作为载体的必要条件1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害1.2基因工程的基本操作程序第2节基因工程的基本操作程序目的基因获取基因表达运载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测和与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库基因组文库与部分基因文库的关系2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因②反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2.基因文库的构建方法(二)利用PCR技术扩增目的基因1.概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术2.原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制(二)利用PCR技术扩增目的基因3.过程PCR（聚合酶链式反应）技术扩增由穆里斯等人于1988年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。PCR反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）变性退火延伸结果：双链DNA分子数为2n可获取大量目的基因3.过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，引物延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链1.概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术2.原理：__________4.方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）5.结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因3.过程:(变性、退火、延伸)1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同二、基因表达载体的构建科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：知识点一：2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围三、将目的基因导入受体细胞其他方法：基因枪法，花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射法3、将目的基因导入微生物细胞（1）常用大肠杆菌：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少（2）大肠杆菌的转化方法•首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。三、将目的基因导入受体细胞检测鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定一、植物基因工程硕果累累1.抗虫转基因植物目的基因（抗虫基因）Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因等2.抗病转基因植物目的基因（抗病基因）病毒外壳蛋白基因病毒的复制酶基因抗真菌转基因植物几丁质酶基因抗毒素合成基因一、植物基因工程硕果累累3.抗逆转基因植物目的基因（抗逆基因）抗除草剂基因抗盐碱和干旱作物耐寒的番茄抗除草剂的大豆调节细胞渗透压的基因鱼的抗冻蛋白基因4.利用转基因改良植物的品质目的基因富含赖氨酸的蛋白质编码基因控制番茄果实成熟的基因与植物花青素代谢有关的基因二、动物基因工程前景广阔1.动物基因工程的应用体现在哪些方面？用于提高动物生长速度用于改善畜产品的品质用转基因动物生产药物用于转基因动物作器官移植的供体二、动物基因工程前景广阔2.如何利用动物基因工程技术提高动物的生长速率?生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)二、动物基因工程前景广阔3.怎样能在其他营养成分不受影响的情况下,降低乳糖的含量?将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组4.简述乳房生物反应器的操作过程？获取目的基因（如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）将胚胎送入母体动物二、动物基因工程前景广阔5.乳房生物反应器的操作过程与转基因动物操作过程有何不同之处？并阐述原因？要在编码蛋白质的基因序列前加上乳腺组织中特异表达的启动子（乳腺蛋白基因的启动子）构成表达载体。因为产品在奶中形成，需要乳腺组织中特异表达的启动子（基因的选择性表达）。二、动物基因工程前景广阔6.用转基因动物作器官移植的供体动物、存在的难题和解决的方法分别是什么？供体动物：小型猪存在的难题：免疫排斥解决方法：在供体基因组中导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。1.利用转基因工程菌生产各种药物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2、人的生长激素、乙肝疫苗等。三、基因工程与疾病治疗DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。知识回顾：基因诊断2.基因治疗取患者骨髓分离的干细胞病毒载体正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内基因治疗的概念：把健康的正常基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。三、基因治疗举例：复合型免疫缺陷症发病机理：细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶的基因发生了突变。体外基因治疗体内基因治疗基因治疗的形式2.基因治疗四、基因芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化