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基因工程GeneEngineering主讲人：王祎玲Email:ylwangbj@yahoo.com.cnPhone:18603570866概述Introduction第一节基因工程的诞生DNA重组技术的定义重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，是指按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新形状的DNA体外操作程序，也成为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。一、基因工程的定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途经工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程二、基因工程诞生的理论基础（1）肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。（2）噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。1.DNA是遗传物质1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。2.DNA双螺旋结构3.中心法则和遗传密码1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码DNARNAprotein三、基因工程诞生的技术突破三、基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖2.DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3.载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4.感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。5.琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6.DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年Nobel化学奖四、基因工程的诞生1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：1.Berg的开创性实验将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。Boyer-Cohen实验StanleyCohen1986Nobel生理或医学奖HerbBoyer外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。1.跨物种性2.无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。五、基因工程的特征2.重组体的制备六、基因工程的主要操作内容1.目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定3.重组体的转化挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。1.对环境的影响2.新型病毒的出现重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。一、基因工程的安全隐患第二节基因工程的安全性将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4.人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。3.癌症扩散1.公众的担忧二、重组DNA研究的安全准则1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。2.专家的态度3.制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。一、基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率第三节基因工程的应用改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。（1）提高CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。（2）提高光能吸收率和转化率使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。2.提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。3.转基因植物中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）转基因植物特性申请单位获批准数马铃薯抗病毒中科院4抗病中国农科院1抗逆北京大学1高营养品质北京大学1水稻抗虫中科院1抗病毒北京大学2抗病农科院2抗除草剂水稻所1棉花抗虫中科院农科院美国孟山都公司9玉米抗虫美国孟山都公司等3大豆抗除草剂农科院1小麦抗除草剂北京农林科学院1高营养品质北京农林科学院1番茄抗病北京大学1耐储存中科院华中农大3甜椒抗病北京大学1将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。4.转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠；分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。二、基因工程在工业中的应用克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1.纤维素的开发利用2.酿酒工业三、基因工程在医药上的应用1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990生产interferon11990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）2.用微生物生产药物3.技术设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗1.用转基因植物或动物生产药物大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂6.法医鉴定7.基因治疗5.基因诊断将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。四、基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2.生物降解用重组细菌或转基因鱼等检测水污染