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2020/2/29用基因工程方法获得胰岛素第四组12020/2/29胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。22020/2/293基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法化学合成A链和B链的编码序列2020/2/294基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法表达产物的后期处理路线：2020/2/295基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略：2020/2/296基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法表达产物的后期处理路线：2020/2/297基因工程制胰岛素三种方法三、A链和B链同时表达法2020/2/298方法一：由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此成本高。方法二：胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。方法三：需体外折叠。基因工程制胰岛素三种方法三种方法比较：2020/2/29基因工程获取胰岛素的步骤一、获取外源目的基因片段二、选择与获取表达载体三、重组目的DNA片段与表达载体四、选择与获取表达细胞五、重组体导入表达细胞六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七、工程菌产物鉴定和保存八、发酵培养92020/2/29一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料2．提取RNA，分离RNA3．逆转录mRNA,得cDNA第一链4．得双链DNA5．DNA序列纠错6.目的基因通过细胞克隆扩增7.目的基因回收及DNA测序，最终目的基因获取102020/2/29一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA，所以用基因工程方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料。112020/2/29一、获取外源目的基因片段2．提取RNA，分离RNA2．1总RNA的提取2．2mRNA的纯化2．3mRNA的保存122020/2/29一、获取外源目的基因片段2．1总RNA的提取总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。132020/2/29一、获取外源目的基因片段2．1．1TRIzol法提取流程（1）样品处理①培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol，混匀，室温静置5min。②组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol充分匀浆，室温静置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。（3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。（5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。（6）加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min，弃上清液。（7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。142020/2/29一、获取外源目的基因片段2．1．1TRIzol法提取流程图152020/2/29一、获取外源目的基因片段2．2mRNA的纯化该方法利用mRNA3＇端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。162020/2/29一、获取外源目的基因片段2．2．1寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（1）试剂准备：①3M醋酸钠（pH5.2）；②0.1MNaOH；③上样缓冲液：20mMTris-HCl（pH7.6）,0.5MNaCl,1MEDTA(pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%；④洗脱缓冲液：10mMTris-HCl（pH7.6），1mMEDTA（pH8.0），0.05%SDS；⑤无水乙醇、70%乙醇；⑥DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）172020/2/29一、获取外源目的基因片段2．2．1寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（2）操作步骤：①将0.5-1.0g寡聚（dT）纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。②用DEPC处理的1ml注射器或适当的细管，将寡聚（dT）纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。③使用1*上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。④将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2*上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1*上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。⑤将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。⑥用5-10倍柱床体积的1*上样缓冲液洗柱，每管1ml分步收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无polyA尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。⑦用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly（A+）RNA，分步收集，每部分为1/3-1/2柱体积。⑧OD260测定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。⑨4℃离心，10000g*15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。4℃离心，10000g*5min，弃上清，室温晾干。⑩用适量的DEPCH2O溶解RNA。182020/2/29一、获取外源目的基因片段2．2．1寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（3）注意事项①整个实验过程必须防止Rnase的污染。②步骤④中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNApoly（A+）尾处的二级结构，使poly（A+）尾充分暴露，从而提高poly（A+）RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。③十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。④寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。⑤一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgpoly（A+）RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。192020/2/29一、获取外源目的基因片段2．3mRNA的保存用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并于-70℃下贮存。202020/2/29一、获取外源目的基因片段胰岛素基因mRNA序列212020/2/29一、获取外源目的基因片段胰岛素基因mRNA序列NCBI中搜索得222020/2/29一、获取外源目的基因片段3．逆转录mRNA,得cDNA第一链mRNA在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNA。加入高浓度的Oligo（dT）引物，，Oligo（dT）引物与mRNA的3'末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序。（原因：oligo（dT）结合在mRNA的3‘端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到）232020/2/29一、获取外源目的基因片段4．得双链DNA4.1合成cDNA第二链得双链DNA4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增242020/2/29一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNAmRNA－cDNA杂合双链中的mRNA链在RNA酶H作用下先形成很多切口，mRNA链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段。这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA的第二链。遗留在5'-末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5'3'核酸外切酶和RNA酶H降解，暴露出与第一链cDNA对应的3'-端部分序列。同时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3'--5'核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端优点:a)合成cDNA的效率高b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA252020/2/29一、获取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二链得双链DNA262020/2/29一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4.2.1模板DNA的变性向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的DNA聚合酶、PCR缓冲液（500mm01／LKCl；100mmol／LTris一HCl(pH8.4)，150mmol／LMgCl2，lmg／m1明胶）、5mmo1／LdNTP贮备液，然后加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备272020/2/29一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4.2.2模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；282020/2/29一、获取外源目的基因片段4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增4.2.3引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。292020/2/29一、获取外源目的基因片段5.目的基因回收纯化及DNA测序纠错5.1将目的基因进行回收纯化5.2对目的基因进行测序5.3DNA序列纠错302020/2/29一、获取外源目的基因片段5.1将目的基因进行回收纯化1)在PCR试管中加入凝胶