肾功能检查的方法评价

1肾功能检查的方法学评价2一、概述肾病常用实验室检查尿液检查肾活检病理检查肾功能检查肾小球滤过功能肾小管功能3肾小球功能检查内生肌酐清除率血清肌酐测定血清尿素测定GFR测定血β2-微球蛋白测定肾小球功能检查4肾小管功能检查近端肾小管功能检测：尿2、α1微球蛋白肾小管功能远端肾小管功能检测昼夜尿比密尿渗量自由水清除值（CH2O）尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）5•测定血液中非蛋白氮成份是衡量肾功能的重要指标。•血液非蛋白成份：指除了蛋白以外的低分子量含氮化合物的总称，主要是尿素，约占50%左右，其它尚有尿酸（UA）、肌酐（Cr）、氨基酸(aa)、核苷酸、肽类及氨等。它们由蛋白分解而来，主要由肾脏排出。6方法•过去是测定NPN（非蛋白氮，non-proteinnitrogen）的量，操作繁琐、结果分析复杂。•现在是测定尿素、Cr等肾功指标。7二、血清尿素（Urea）的测定•1、早期的生化方法测定尿素是用氮定量的方法，故临床上仍习惯将尿素测定称为尿素氮测定。每60克尿素含氮28克,1mmol/LBUN=1/2mmol/LUrea。•2、尿素来源：是体内氨基酸分解的终产物之一，由氨基酸生成NH3和CO2,主要在肝脏经鸟氨酸循环的代谢过程而逐步合成，经血液运输至肾、由尿液排出体外。全血值较血清值低，临床上常测血清标本。•3、单位：WHO推荐用mmol/LUrea表示浓度。8血清尿素（Urea）测定的方法•直接法---二乙酰一肟法：WHO推荐的常规方法•间接法---尿素酶法（参考方法）•决定性方法---ID-MS9（一）二乙酰一肟法•1、原理：尿素与二乙酰一肟在强酸溶液，经加热生成红色二嗪衍生物，称为Fearon氏反应，在540nm比色。二乙酰一肟+H2O+H+双乙酰+羟胺双乙酰+尿素+H+红色二嗪衍生物+2H2O加热加热10•2、注意事项①羟胺是干扰物质，要用氧化剂除去，如过硫酸盐、砷酸、过氯酸、氯胺T以及一些阳离子。现在磷酸即做酸介质又作氧化剂。②加入氨基硫脲和Fe3+（有氧化作用可以消除羟胺的干扰）或Cd2+（镉离子）可增加呈色的稳定性，提高反应灵敏度。③在呈色反应时，A要逐渐降低，30分钟内降低6%，1h降低12%，2h降低15%，所以宜在30分钟内比色。113、评价优点①WHO推荐的常规方法，简便快速精确②550nm波长比色最灵敏，且可摒除蛋白干扰，故标本无需作去蛋白处理③线性范围宽，达140mol/L④干扰因素少：黄疸、溶血、BIL一般无影响⑤特异性较好：少量鸟氨酸循环的中间产物（瓜氨酸）等要干扰反应，但含量甚微，可认为无影响12缺点•①特异性不如酶法•②强酸有刺激性、腐蚀性•③反应期间有臭味13（二）尿素酶法（脲酶法）1、原理：先用尿素酶特异性地水解尿素，生成氨和CO2，再用一些方法来定量。尿素+H2O2NH3+CO2进一步可用以下方法定量：①②③④尿素酶14①Berthelot氏反应（尿素酶-靛酚显色法、酚-次氯酸显色法、脲酶－波氏比色法）：原理：NH4++NaClO+2酚吲哚酚+5NaCl+5H2O•吲哚酚：蓝色解离型（630nm）•催化剂：亚硝基铁氰化钠•评价：简便，专一性好灵敏度高、结果准确，批内CV2.7-3.9%，血清用量少（10μl即可），最终稀释度大，故不需要去蛋白。•参考值：2.86-8.2mmol/LOH-15②尿素酶-纳氏试剂显色法碳酸铵+纳氏试剂+8NaOH→2[Hg2ONH2]I棕黄色沉淀+8KI+6NaI+NaCO3+6H2O③尿素酶-谷氨酸脱氢酶法:α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+H+反应要消耗NAD(P)H，340nm测A的减少，用终点法或速率法。④电化学方法尿素由非离子化状态→NH4+，可用自动化电导仪测定导电率变化；或用NH4+ISE来测定电位变化。谷氨酸脱氢酶NAD(P)++H2O+谷氨酸162、评价优点：特异性强、灵敏度高、准确性好要求：①尿素酶是蛋白，故酸、碱、重金属均会破坏或影响其活性。②pH、温度、时间要严格掌握③防止环境中的NH3污染。(①②为酶促反应的特点)17三、肌酐(Cr)的测定•肌酐是肌酸的代谢产物，由肾脏排出。血液中也有少量的肌酐，一般与BUN同时测定，用以了解肾功，两者比值(血清BUNmg/dl:血清Crmg/ml)在正常情况下为12~20，计算比值可粗略判断肾性或肾外因素所致的氮质血症，还可测血与尿中肌酐，以计算肾小球滤过率。•方法：决定法方法ID-MS、离子交换层析法，参考方法：HPLC常规方法：去蛋白苦味酸显色(Jaffe反应)法、不去蛋白Jaffe拟一级动力学法(速率法)酶法18(一)、苦味酸法(Jaffe氏反应)1、原理：Jaffe于1886年报告的。肌酐与苦味酸在碱性介质中生成橙红色(510nm)的苦味酸肌酐复合物。2、消除假肌酐干扰的方法：假肌酐：血浆中的葡萄糖、VitC、丙酮酸、蛋白质、乙酰乙酸、丙酮等均能与碱性苦味酸作用，生成红色化合物。在Jaffe氏反应中，约占总量的1/4，RBC内更高，故测定肌酐时一般用血浆或血清标本。消除假干扰的方法：①②③④⑤19•①制备无蛋白血滤液或在反应体系中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，与蛋白形成不与苦味酸起反应的复合物，加入硼砂与葡萄糖、VitC形成非反应的复合物。•②二次比色法：特异性高，可用血清直接测定。Jaffe氏反应后先进行第一次比色，测得真假肌酐的总A，再在反应体系中加入肌酐酶或6N的醋酸，以分解真肌酐，再进行一次比色测假肌酐，二次A值之差即为真肌酐的A值20•③用硅酸铝土或阳离子交换树脂等吸附真肌酐，再洗脱、Jaffe氏反应。方法繁杂、准确度受影响。•④用控制pH值的方法来消除干扰：在pH12时，假肌酐的干扰很小。在pH10时，作一个血清蛋白，减去空白和蛋白干扰纠正常数•⑤速率法：特异、快速，用于自动化分析仪在Jaffe氏反应中，乙酰乙酸在最初20秒与苦味酸形成复合物较快，在20~80秒间则主要是真肌酐起起反应，80秒以后是其他干扰物。于是测定反应后20~60秒间A21(二)、酶法•评价：特异性高、快速、操作简便。但酶试剂来源较困难、操作中温度、pH值、保温时间均要控制。•方法：①部分酶法:Jaffe氏反应后肌酐酶二次比色法、肌酐酶法②全酶法：22•1、肌酐亚氨基水解酶(肌酐酶)法肌酐+H2ONH4++N-甲基乙内酰脲再对NH4+进行定量，方法如下：①NH4+离子选择电极法②用指示剂(溴酚蓝)与铵染色定量③偶联谷氨酸脱氢酶法：α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+H+NAD(P)++H2O+谷氨酸(340nm测定A值变化)注：以上方法测NH4+要防止内源性氨、环境氨的污染肌酐酶谷氨酸脱氢酶232、肌酐酰氨基水解酶法(全酶法)谷氨酸脱氢酶肌酸肌酐+H2O评价：特异性高、可用终点法或速率法肌酸激酶磷酸肌酸ATPADP丙酮酸激酶丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸NAD(P)H+H+NAD+LDH测定340nmA值的变化243、HPLC：参考方法应用离子对技术，反向柱，于200nm波长定量评价：高度特异性，但要一定的技术条件25内生肌酐清除率测定(Ccr)外源性肌酐肌酐内生性肌酐大部分从肾小球滤过，不被肾小管重吸收，排泌量很少，其清除率基本代表GFR。26•试验操作方法：1.低蛋白饮食、禁肉食、避免剧烈运动3天。2.收集24h或4h尿液（甲苯防腐），同时取血2~3ml3.测定血、尿中肌酐浓度、记录尿量4.计算•参考范围：80～120ml/min（成人）27•临床意义：判断肾小球损害的敏感指标评估肾功能损害程度指导临床治疗28四、血清尿酸(UA)测定•尿酸是核酸中嘌呤分解代谢的终产物，是血浆中NPN成份之一，且有酸性和还原性•决定性方法：ID-MS•参考方法：尿酸酶法(紫外法)•磷钨酸还原法：已淘汰29(一)氧化还原法1、磷钨酸法(已淘汰，干扰多)尿酸+磷钨酸→尿素+CO2+钨蓝2、杂菲铁法(快速简便，VitC干扰)UA+Fe3++H+→UA氧化产物+Fe2+Fe2++1,10-二氮杂菲→505nm比色30(二)尿酸酶法UA+O2+2H2O尿素+CO2+H2O2紫外法：UA在282~292nm有吸收峰，酶作用后消失酶联比色法：测定H2O2酶联紫外法：(三)固相酶尿酸酶