脓汁和粪便标本中病原菌的检测-5

器材准备斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，微量发酵管1套，青链庆纸片1套，眼科镊子2把。医学微生物学实验综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五）糖发酵试验药敏试验血浆凝固酶试验半固体接种法糖发酵试验SugarFermentationTest不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。糖发酵管:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等。指示剂：溴甲酚紫，PH≥6.8为紫色，≤5.2为黄色。原理：多糖→单糖→丙酮酸、酸性产物(产气)→pH↓→指示剂呈酸性变色。结果:培养基变色无气泡“+”，培养基变色有气泡“⊕”，培养基不变色“-”。应用:观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。甲→紫黑→①葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丙→粉红→③葡萄糖丁→粉红→④乳糖2-3cm37℃24小时细菌的糖发酵试验实验分组俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲乙4丙丁甲乙3丙丁甲乙2丙丁甲乙1丙丁甲乙5丙丁甲乙8丙丁甲乙7丙丁甲乙6丙丁甲乙10丙丁甲乙9丙丁讲台抗菌素敏感性试验AntibioticSusceptibilityTest磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929年发现，1945年临床应用。我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房抗菌素使用率达100%。为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时），做药物敏感性试验。滤纸片扩散法DiscAgarDiffusionMethod将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。敏感（Sensitive）：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。耐药（Resistant）：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治愈。☆试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。抗菌素敏感性试验分工甲→黄色菌液→平板+青、链、庆纸片。乙→白色菌液→平板+青、链、庆纸片。丙→紫黑菌液→平板+青、链、庆纸片。丁→粉红菌液→平板+青、链、庆纸片。※每人1个营养琼脂平板抗菌素敏感性试验方法接种环取菌液3～5ul×2环,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”(注意：操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。※试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。灭菌取菌液2次甲→黄色菌液乙→白色菌液丙→紫黑菌液丁→粉红菌液3～5ul+3～5ul接种线呈十字形纸片扩散法：菌液→密集涂布平板→标记:青、链、庆→贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→按压→倒置培养18～24小时→观察结果。青链庆青链庆标记贴抗菌素纸片凝固酶试验CoagulaseTest致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。葡萄球菌产生两种凝固酶:一种是与细胞壁结合的凝固酶,为结合凝固酶;另一种是细胞释放于培养基中,为游离凝固酶；二者抗原性不同。在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁殖、引起感染。体外试验有试管法和玻片法两种。试管法检测游离凝固酶，结果准确。玻片法只能检测结合凝固酶，比较简便，常作为快速筛选技术（金黄色葡萄球菌中有10%～15%可呈阴性反应）。凝固酶试验试管法：游离凝固酶→凝血酶↓纤维蛋白原→纤维蛋白→血浆凝固↑凝固酶试验玻片法：结合凝固酶（菌体表面）↓纤维蛋白原→纤维蛋白→细菌凝集↑凝固酶试验玻片法取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。菌液出现明显凝块为阳性，否则为阴性。※白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。※反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。载玻片1张兔血浆各15ul右侧血浆与白色菌苔混合左侧血浆与黄色菌苔混合半固体穿刺接种法StabSemisolidMethod具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈扩散云雾状混浊状态。无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。甲→紫黑，乙→紫黑；丙→粉红，丁→粉红。半固体穿刺接种法甲→紫黑,乙→紫黑,丙→粉红,丁→粉红。37℃,24小时标记:组号,颜色生物安全警告本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）操作，可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。细菌的糖发酵试验P16甲→紫黑→①葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丙→粉红→③葡萄糖丁→粉红→④乳糖细菌的药敏试验P20（菌液）甲→黄色→平板+青、链、庆纸片乙→白色→平板+青、链、庆纸片丙→紫黑→平板+青、链、庆纸片丁→粉红→平板+青、链、庆纸片血浆凝固酶试验P17兔血浆15ul+黄色,白色半固体接种法P11甲→紫黑，乙→紫黑，丙→粉红，丁→粉红。思考题细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义?为什么要在发酵管液面上方大约2～3cm处切割？培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？抗生素敏感性实验有何实际意义?血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么?半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”?为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照?微量发酵管管口朝下，37℃培养18～24小时。塑料筐一侧垫高常用器材摆放顺序：电源插座→试管架→酒精灯→污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1和第2列分别放置接种针和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。※器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。实验器材整齐有序