细菌药敏试验

第四章抗菌药物敏感试验黄露萍抗菌药物敏感试验测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（AntimicrobialSusceptibilityTest），简称药敏试验（AST）。药敏试验的意义预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。药敏试验MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是18～24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。对倍稀释的优点：操作容易敏感株的MIC呈正态分布区分异常(R)与敏感(S)的菌群药敏试验折点的建立1.MIC的分布2.药代动力学和药效学定MIC的折点3.临床疗效和细菌清除率4.抑菌圈直径的分布………定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率：尽可能减少极重要误差(假敏感率)MIC的分布051015200.0080.0320.1250.52832128512药代动力学和药效学药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄药效学：药物对机体的作用时间依赖型（％TMIC〕：β-内酰胺类，大环内酯类浓度依赖型（AUC/MIC比率〕：AGS,FQ这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案MIC与抑菌圈直径的线性关系耐药中介敏感RISLog2.MICD1d2抑菌圈直径（mm)v抑菌圈直径与MIC的关系MIC(ug/ml)123522222111122581112512568小误差中介3234耐药重要误差小误差9敏感小误差极重要误差小误差24262830141820220.250.510121248256256163264128不同国家的判定折点－可能不同原因：用药剂量不同，服药的间隔不同评价敏感时较保守更强调检测出耐药株（即特定的耐药群）技术因素：接种、培养基在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌药物选择原则。CLSI的简单介绍NCCLS（TheNationalCommitteeforclinicallaboratoryStandards）美国临床实验室标准委员会已经被我国卫生部指定为部颁标准每年有新版CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）美国临床实验室标准化研究所2012年CLSI临床微生物检验标准及操作规范M100-S20Tables：抗菌药物敏感性试验的实施标准M2-A10：纸片扩散法敏感性试验的实施标准M07-A8：需氧菌稀释法敏感性试验方法M11-A7:厌氧菌敏感性试验方法M47-A8:血培养的原则和步骤M35-A2:细菌及酵母样真菌的鉴定方法简本*M100每年更新一次**M2,M7每三年更新一次3判断折点特殊的耐药监测标准菌株质控范围药物分组敏感性分类(CLSI的定义)敏感（Susceptible）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC5倍以上。耐药（Resistance）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度敏感性分类（2）中介(Intermediate)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效(尿-FQ)加大用药剂量可能有效缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误药敏试验的方法学半定量…纸片扩散法(抑菌圈直径)MIC法：稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法(Etest)流式细胞仪将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。纸片扩散法（Kirby-Bauer法）操作方法：1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarlandNo0.5管。4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。5.平板置室温干燥3~5分钟，用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。6.盖上平板的盖子，置35℃培养箱内孵育16~18小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24小时。7.用游标卡尺或直尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感(susceptible,S)、耐药(resistant,R)、中介(intermediate,I)。2020/2/2925纸片扩散法－影响因素MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量、扩散性平皿厚度温度，预孵育时间2020/2/2926纸片扩散法－标准化CLSI：美国实验室标准化委员会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测2020/2/2927CLSI的法规规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控；规定常规测试报告的抗生素；不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。2020/2/2928常规测试并报告的药物分组(1)肠杆菌科绿脓和非肠杆菌科一级氨苄西林头孢他啶，庆大霉素头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林二级阿米卡星阿米卡星氨苄西林/舒巴坦头孢吡肟，头孢哌酮阿莫西林/克拉维酸氨曲南头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南头孢噻肟，头孢曲松替卡西林/克拉维酸环丙沙星，亚胺培南妥布霉素，复方磺胺替卡西林，哌拉西林三级氨曲南，头孢他啶头孢曲松卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素四环素，氯霉素2020/2/2929常规测试并报告的药物分组(2)葡萄球菌肠球菌一级苯唑西林，青霉素青霉素，氨苄西林二级红霉素类万古霉素克林霉素，万古霉素三级氯霉素庆大霉素2020/2/2930常规测试并报告的药物分组(3)流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素复方磺胺复方磺胺二级头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素头孢他啶，氯霉素万古霉素三级阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素2020/2/2931预报用药(一)测试药菌名推测其他药物的敏感性苯唑西林葡萄球菌所有β-内酰胺类四环素所有（除葡多西环素，米诺环素萄球菌和不动杆菌〕红霉素G＋球菌罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素所有林可霉素2020/2/2932预报用药(二)测试药菌名推测其他药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林替卡西林头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄头孢克罗奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类万古霉素所有替考拉宁以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。药敏试验-稀释法常用抗菌药物容积稀释法步骤浓度（mg/mL）来源体积(mL)CAMHB(mL)最终浓度（mg/mL）15120储存液195122512步骤1112563512步骤1131284512步骤11764564步骤41132664步骤41316764步骤417888步骤711498步骤7132108步骤7171111步骤10110.5121步骤10130.25131步骤10170.125原理：聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入100μl浓度为105CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃16～20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代培养，经35℃过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.9％原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。微量液体稀释法(microdilutiontest)操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解2.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。3.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。4.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终浓度105CFU/ml。5.用微量加样器接种100μl到96孔中，盖上盖板。同时作阳性、阴性对照。6.手工看浊度或仪器自动判读。按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物为敏感、耐药和中介。阅读结果的正确光源细菌反射光透射光细菌反射光透射光肠杆菌科细菌√肺炎链球菌√(移去盖子)铜绿假单胞菌√β-、草绿色链√(移去盖子)不动杆菌属细菌√嗜血杆菌属√伯克霍尔德菌√淋病奈瑟菌√(移去盖子)葡萄球菌√VAN、OXA、LIN脑膜炎奈瑟菌√(移去盖子)肠球菌√VAN弧菌属√注：阅读葡萄球菌中应注意的纸片法药敏结果是任何有可见的菌落生长均应视作对VAN、OXA、LIN抗菌药物耐药2020/2/2941肉汤稀释法48163264128256ug/ml混混清抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml，孵育35℃，16～20h，判读。2020/2/2942琼脂稀释法浓度163264128256ug/ml制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每个点，孵育，判读结果2020/2/2943肉汤稀释法调节离子浓度的MH肉汤宏量肉汤法（2ml,13x100mm）微量肉汤法（0.1ml,微量板）自动化仪优点：准确，可靠，可用于研究。缺点：劳动强度大细菌生长情况不可查2020/2/2944琼脂稀释法优点：金标准精确可靠可同时测定多株菌（40株）细菌生长情况可查缺点：测多个药时劳动强度大制备平皿费时费力Etest法E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围；将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。操作方法：1~4步骤与纸片扩散法相同。5.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置1～2试条。6.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。7.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。2020/2/29wanghui-ART48Etest法细菌生长区Etest塑料条椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度（MICug/ml)2020/2/2949Etest法优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分枝杆菌2020/2/2950联合药物敏感试验体外联合药物敏感试验的目的：扩大抗菌谱，治疗混合感染预防或推迟细菌耐药性的发生联合用药可以减少剂量景避免达到毒性剂量对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药时效果更好。联合药物敏感试验抗菌药物联合用药可出现4种结果：无关作用：两种药物联合作用的活性等于其单独活性。拮抗作用：两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。累加作用：两种药物联合作用时的活