肺炎链球菌的分离和鉴定

肺炎链球菌的分离和鉴定卫生部北京医院陈东科概述肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。一、生物学性状1.形态与染色肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。2.培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（5％马血或羊血）。琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。（2）分离培养1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。3）培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。肺炎链球菌鉴定要点革兰阳性双球菌，矛头状，不呈链；血平皿菌落呈草绿溶血，湿润，菌落表面无小白点；培养时间长出现脐窝状；胆汁溶解试验阳性；乳胶单克隆抗体凝集阳性。1.溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。2.Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的optochin纸片，置5~10%CO2的大气中（或烛缸），35℃孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径=14mm。应注意鉴别。但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。3.胆汁溶菌试验自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。（1）试管法:取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。（2）平皿法:加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。4.乳胶凝集试验结果准确、快速、特异性高。5.荚膜肿胀试验取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。6.凝集试验包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。表1非β溶血链球菌的鉴别————————————————————————————————————菌种Optochin胆汁胆汁6.5%NaCl吡咯烷卫星现象CAMP血清群敏感溶菌七叶苷肉汤酮酶————————————————————————————————————肺炎链球菌++——————牛链球菌——+————D无乳链球菌———d——+B草绿色链球菌————————营养变异链球菌————++——————————————————————————————————————*d.不同菌株三、肺炎链球菌的药敏试验K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。培养条件：为35℃、5％CO2培养20～24小时。质控菌株ATCC49619。1.肺炎链球菌的耐药机制青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉素G的结合力下降；青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于1967年；多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在南非爆发流行。肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由ersB(erythromycinresistancemethylase)基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导，其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素B敏感。耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径:(1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。(2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来,或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株”。随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用,可以预计不久的将来,不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。2.耐青霉素肺炎链球菌的检测纸片扩散法对β内酰胺类药物结果的准确性不够，用1μg/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时，当抑菌环直径小于20mm时，就必须做稀释法证实是耐药。3.肺炎链球菌的药敏报告用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当抑菌环≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可报告青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。肺炎链球菌的药敏报告（续1）当苯唑西林抑菌圈≤19mm时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的MICs，因为抑菌环≤19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。肺炎链球菌的药敏报告（续2）当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常规报告MICs。测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。4.肺炎链球菌感染的治疗青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗;青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进行治疗；如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗。总结1.肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件致病菌；2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液的培养基中生长良好；3.以optochin试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌与其他－溶血链球菌相区别；4.血清学鉴定特异性高；5.要注意对PRP和MDR的检测。谢谢！！！