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第一章样品的前处理技术1、超临界流体萃取的定义；超临界流体的性质；提携剂的作用；超临界萃取典型流程超临界流体萃取的定义：用超临界流体作为溶剂，用来有选择性地溶解液体或固体混合物中溶质的分离技术称为超临界流体萃取。超临界流体的性质：（1）超临界流体的传递性质超临界流体的密度与液体接近；粘度与普通气体接近；自扩散系数也远远大于一般液体。因此，与一般溶剂相比，在超临界流体中，可更快进行传质，短时间内达到平衡，从而高效地进行分离。甚至可以简化固体粉末的预处理。（2）超临界流体的溶解性能超临界流体的密度接近液体超临界流体的密度接近液体，超临界流体对液体、固体的溶解度也与液体接近。超临界流体溶解能力与压力、温度及是否加入提携剂有关。（3）提携剂提携剂也称共溶剂、修饰剂、改进剂,是一种加入超临界流体系统中的少量溶剂,它的加入能明显改变超临界流体系统的相行为,可增加溶解度；可降低操作压力或减少流体的用量超临界萃取典型流程：超临界流体萃取过程基本上由萃取阶段和分离阶段组成，右图就是三种典型的流程。2、固相萃取的原理，作用，操作程序（活化、上样、洗涤、洗脱）固相萃取的原理固相萃取(SolidPhaseExtraction，简称SPE)，也称固相提取，是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术。当复杂的样品溶液通过吸附剂时，吸附剂会通过作用力选择性地保留目标化合物或者干扰物，其他组分则透过吸附剂流出小柱，然后用另一种洗脱能力较强的溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来，从而实现对复杂样品的分离、纯化和富集。固相萃取的作用：净化：去除干扰物，优化色谱图，增加定量准确性富集：浓缩样品增加灵敏度转换溶剂：适合色谱分析保护色谱柱不受污染,延长使用寿命固相萃取操作程序：（活化、上样、洗涤、洗脱）（1）活化吸附剂：萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。（2）上样（吸附）：倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。（3）洗涤（去除杂质）：在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉（4）洗脱3、固相微萃取的原理（数学表达式），SPME的特点（集取样、萃取、富集、进样于一身）；提高固相微萃取萃取效率的方法固相微萃取的原理（数学表达式）对于一个单组分的单相体系,当被分析有机物在萃取头与萃取体系之间达到平衡时,分析物与萃取头之间有一分配系数K,该分配系数与分析物在萃取体系中的量有如下关系:式中:N为吸附于萃取头上分析物的量;C0为萃取前分析物在样品中的浓度;K为分析物在萃取头和样品间的分配系数;Cs为分析物在萃取后样品中的浓度;Cf为分析物在萃取头中的浓度;Vf为萃取头的体积;Vs为样品的体积。可以看出,体系中的K及Vf值是影响方法灵敏度的重要因素。1T1T2432P1T22P2T2345T1P1P22T234T1P2P111(a)等温法(b)等压法(c)吸附法T1=T2P1＞P2P1=P2T1＜T2T1=T2P1=P21—萃取槽3—分离槽4—压缩机1—萃取槽2—加热器3—分离槽5—冷却器1—萃取槽2—吸收剂3—分离槽4—泵2—膨胀阀SPME的特点（1）SPME的特点是集取样、萃取、富集、进样于一身。（2）SPME易于操作,是试样与固相涂层直接作用,几乎不消耗溶剂,降低了成本,保护了环境。SPME的速度取决于分析物分配平衡所需的时间,一般在2～30min内即可达到平衡。该技术适用于微量或痕量组分的富集。（3）SPME是一种基于气固吸附(吸收)和液固吸附(吸收)平衡的富集方法,利用分析物对活性固体表面(熔融石英纤维表面的涂层)有一定的吸附(吸收)亲合力而达到被分离富集的目的。（4）SPME技术是根据有机物与溶剂之间的“相似者相溶”的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相或吸附剂对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来,并逐渐富集,完成此试样前处理过程1在进样过程中,利用气相色谱进样口的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来,由色谱仪进行分析。提高固相微萃取萃取效率的方法萃取过程中不可避免地出现由于萃取涂层体积远远小于样品体积而在竞争吸附中造成萃取灵敏度低的问题。针对这种情况，可以采用下列几种方法解决：（1）加热样品提高待测物质的挥发度，加快传质速率。这时需要注意的一个问题是,由于温度的升高，会使待测物在顶空与涂层间的分配系数下降，导致涂层吸附能力降低。所以，在实际操作中应选择一个最佳萃取温度或在加热样品的同时将萃取纤维用干冰冷却保护起来。减少顶空体积和不断搅拌样品也有利于提高萃取效率。对于土壤样品，在加热的同时还可以加入少量水或表面活性剂来作调节剂，以提高萃取效果。例如，在高温下涂层吸附含水10％的土壤样品中的待测物要显著高于不含水的样品。（2）增加涂层的厚度是提高吸附量、降低检测限的另一途径。而且不同涂层厚度适用的对象也不同。通常，涂层薄的石英纤维适合于萃取分子量大的化合物，而涂层厚的则适宜于易挥发和分子量小的化合物。（3）衍生化：对于强极性待测物还发展了现场衍生化的方法，通过衍生反应来降低待测物的极性，使得易于分析。目前普遍使用的有两种衍生化方法①先将衍生试剂加入待测样品中进行衍生化反应后再进行SPME处理；②先将萃取纤维浸入衍生试剂中，待涂层中吸附了一定量的衍生试剂后进行SPME处理，这时在纤维涂层上萃取过程和衍生化反应同时进行。为了提高高分子涂层对有机物的萃取能力，可以通过在水样中加入盐类（NaCl、Na2SO4）调节样品离子强度达到这一目的。由于非离子涂层只能有效萃取中性物质，所以，某些时候为了防止待测物质的离子化，还需要调节溶液的pH值。在实际操作中，应根据所处理样品的不同而灵活选用各种方法。第二章生物检测技术1、PCR的过程（变性、退火、延伸）及反应条件；PCR反应试剂；PCR过程：(1)DNA模板的解链（变性）理论上，在90℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。(2)DNA单链与引物的退火（复性）引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起(3)引物的延伸（新链DNA的合成）①首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的，3’端没有固定的终止点，长短不一。②第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点。③N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。反应条件：（1）预变性：94℃300s（高温起动:充分变性，防止非特异性扩增）（2）变性：90℃-95℃，30s-60s（3）退火：55-65℃30s-45s（4）延伸：70-72℃30-60s（2kb)25-35次cycle后，延长延伸（72℃，10min；充分延伸),冷却至4℃或加入EDTA至10mmol/L以终止反应。PCR反应试剂：（1）模板：单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。（2）引物浓度：0.2-1mol/L。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)：0.5-2.5U/50l。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP：dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等（5）Mg2+：Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。（6）标准的缓冲液：10Xbuffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT）（7）无菌双蒸水或三蒸水（8）石蜡油或矿物油:30~50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）2、基因芯片(DNA芯片)的定义;原位光刻合成步骤；合成点样中微型机械点样法的步骤基因芯片(DNA芯片)的定义：又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片制备的基本方法之一----原位光刻合成步骤(1)把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。(2)根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基。(3)引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP。(4)更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕。基因芯片制备的基本方法-之一-----合成点样---微型机械点样法的步骤是什么？合成点样是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。微型机械点样法：通过毛细作用使用点样针将生化物质转移到固体基底表面（点样针与基底表面接触）。第一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操作。机器人控制系统可使其实现自动化生产3、探针是什么？核酸探针技术原理；核酸探针标记物；了解核酸分子杂交方法---Southern杂交、Northern杂交探针定义：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。核酸探针技术原理核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。核酸探针标记物：（1）放射性核素（2）非放射性标记物：①生物素②地高辛③荧光素：FITC，罗丹明了解核酸分子杂交方法（1）Southern杂交定义：Southern印迹杂交是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。程序：限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→转印到NC膜或尼龙膜→碱变性、中和→预杂交、杂交→放射性自显影基本原理：毛细管转移（2）Northern杂交定义：将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。过程：①实验准备②制备凝胶③样品的处理④RNA电泳⑤RNA的转移4、ELISA基本原理；ELISA测定方法的操作步骤及关键点ELISA基本原理在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。ELISA测定方法的操作步骤及关键点（1）加样：在ELISA中除了包被外，一般需进行4~5次加样。（2）保温：ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。（3）洗涤：洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。（4）比色：ELISA板的实验结果可用肉眼观察，也可用酶标仪测定。肉眼观察也有一定准确性。（5）结果判定：①用“+”或“-”表示。超过规定吸收值的标本均属阳性，此规定的吸收值是根据事先测定大量阴性标本取得的，是阴性标本的均值加两个标准差。②直接以吸收值表示。吸收值越大，阳性反应越强，此数值是固定实验条件下得到的结果，而且每次都伴有参考标本。③以终点滴度表示。将标本稀释，最高稀释度仍出现阳性反应，为该标本的滴度。④以P/N表示。求出该标本的吸收值与一组阴性标本吸收值的比值，大于1.