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大纲要求掌握分枝杆菌属的生物学特性、抗酸染色法了解不典型分枝杆菌了解放线菌属细菌的致病特点第一节分枝杆菌属P265分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长或稍弯的杆菌,因有分枝生长的趋势而得名。此菌属的最显著的特性为其胞壁中含有大量类脂，达菌体干重的40%左右，故生长形成粗糙的疏水性菌落，且难以用一般染料染色。若设法使之着色后，又不易以含3%HCl的酒精脱色。这种能抵抗盐酸酒精脱色的细菌称为抗酸杆菌。引起人类疾病的种有：(1)人型、牛型结核分枝杆菌;(2)麻风分枝杆菌;（3）部分条件致病菌现已证实也可引起严重的感染。本菌属细菌感染多数为慢性感染过程，长期迁延，并有破坏性的组织病变。一、结核分枝杆菌结核分枝杆菌（MycobecteriumTuberculosis,TB）简称结核杆菌，引起结核病。以人型和牛型分枝杆菌致病多见。结核分枝杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为常见，结核病至今仍为第三世界国家重要的传染病，且近年来有上升趋势。(一)生物学性状1、形态染色结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，在生长中可见分枝。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用萋～尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。镜下可见堆积成团、成束、排列不规则，有呈链状、索状者。革兰染色不易着色，通常视为革兰阳性，既往曾在组织中发现革兰阳性非抗酸颗粒，接种动物可产生典型结核样病变，曾被称为Much颗粒。形态染色结核杆菌细长略弯曲，在生长中可见分枝。用萎～尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。(一)生物学性状2、培养特性:专性需氧，在无氧条件下迅速死亡。营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基(如Lowenstein-Jensen,罗-杰培养基)上才能生长。最适pH6.5～6.8，最适温度为37℃，生长缓慢，接种后培养3～4周才出现肉眼可见的菌落。菌落为凸起、边缘不整、干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样。在液体培养内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基内加入水溶性脂肪酸，如Tween～80，可降低结核杆菌表面的疏水性，使呈均匀分散生长。有毒株在液体培养基中可呈现索状生长。培养特性AmicrocolonygrowingonthesurfaceofMiddlebrook7H10agar,observedmicroscopicallyunderlow-poweroptics.Notethatthebacterialcellsarearrangedinanundulating,serpiginouspattern.Thisindicatestheproductionofcordingfactor.asillustratedintheacid-faststainshowninColorPlate17-1I培养特性AflaskofLowenstein-JensenmediumonwhicharegrowingcoloniesofM.tuberculosisaftera22dayincubationat35Cina10%CO2incubator.Thecoloniesseenherearedistinctlyroughinconsistency;however,theyhavemoreofayellow'pigmentationthanthebuff-coloredcoloniesusuallyobserved.AflaskofLowenstein-JensenmediumonwhicharegrowingcoloniesofM.tuberculosisaftera22dayincubationat35Cina10%CO2incubator.Thecoloniesseenherearedistinctlyroughinconsistency;however,theyhavemoreofayellow'pigmentationthanthebuff-coloredcoloniesusuallyobserved.培养特性培养特性ColoniesofasubcultureofM.tuberculosisgrowingonMiddlebrook7H10agaraftera25-dayincubationat35Cin10%CO2incubator.Thecolonieshavearough,buffappearance,characteristicforthespecies.(一)生物学性状3、菌体成分及抗原性(1)蛋白质:结核杆菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素(tuberculin)。结核菌素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。PPD:seibert提取的纯蛋白衍化物PPD-standard:由结核菌素中提取的标准纯蛋白衍化物PPD-Rt23:更纯的蛋白成分，可引起IV型变态反应。(一)生物学性状3、菌体成分及抗原性(2)脂质（Lipide）：脂质占菌体干的20～40%，占胞壁干重的60%。其中结核菌酸(phthioticacid)引起机体形成结核结节。分枝菌酸与抗酸性有关。①蜡质D和多肽糖：具有佐剂活性，其中6,6～双分枝海藻糖(6,6～Dimycocyl～a,a‘～D～trehalose)能使结核菌生长成条索状，故称为索状因子(cordfactor)。它能作用于吞噬细胞的线粒体影响细胞呼吸及氧化-磷酸化作用；能抑制中性粒细胞游走、使激活的巨噬细胞聚集及刺激慢性肉芽肿的形成。(一)生物学性状3、菌体成分及抗原性②硫脂(salfatides)：能增加索状因子的毒性，抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。③磷脂：可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成干酷样坏死。④硫脂和磷脂能与中性红染料结合，产生中性红反应，借此可鉴定结核杆菌有无毒力。(一)生物学性状4、变异性：结核分枝杆菌经多次传代培养后，毒力可以减弱或消失。1908年卡～介（Calmette-Gerine）二氏将牛型结核杆菌培养于胆汁、甘油、马铃薯培养基中，经230次传代，历时13年，使其毒力发生变异，成为对人无致病性，而仍保持良好免疫性的菌苗株，称为卡介菌(BacilliCalmette-Giierin,BCG)，1921年开始应用于人类预防接种。卡介菌接种人体后，可获得抗结核受疫力。(一)生物学性状5、抵抗力结核杆菌对某些理化因子的抵抗力较强。在干痰中存活6～8个月，若粘附于尘埃上，保持传染性8～10天。在3%HCl或NaOH溶液中能耐受30分钟，因而常以酸硷中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热62～63℃15分钟，直射日光下2～3小时，75%酒精内数分钟即死亡。(二)临床意义结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型变态反应性损伤有关。结核杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官，引起相应器官的结核病，其中以肺结核最常见。人类肺结核有两种表现类型。(二)临床意义原发感染原发感染是首次感染结核杆菌，多见于儿童。结核杆菌随同飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡，被巨噬细胞吞噬后，由于细菌胞壁的碳酸脑苷脂抑制吞噬体与溶酶体结合，不能发挥杀菌溶菌作用，致使结核杆菌在细胞内大量生长繁殖，最终导致细胞死亡崩解，释放出的结核杆菌或在细胞外繁殖侵害，或被另一巨噬细胞吞噬再重复上述过程，如此反复引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。原发灶内的结核杆菌可经淋巴管扩散在肺门淋巴结，引起淋巴管炎和淋巴结肿大，X线胸片显示哑铃状阴影，称为原发综合征。随着机体抗结核免疫力的建立，原发灶大多可纤维给的钙化而自愈。只有极少数免疫力低下者，结核杆菌可经淋巴、血流扩散至全身，导致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。(二)临床意义继发感染继发感染也称原发后感染，多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。继发性感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。(二)临床意义郭霍氏现象（Koch‘sphenomenton）：在健康豚鼠皮下首次注射一定量结核杆菌，10～14天后注射部位缓慢地出现溃疡，深而不易愈合，邻近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，直至死亡。若在8-12周前给动物接种过减毒的或小量结核分枝杆菌，则第二次接种的局部反应提前出现，在2～3天内即迅速发生溃疡，但溃疡浅而易愈合，邻近淋巴结不肿大，细菌也很少扩散。此现象于1891年由Koch发现，故称Koch现象。(二)临床意义首次感染出现的炎症反应偏重于免疫预防，溃疡浅而愈合，细菌不扩散，说明机体尚未建立起抗结核免疫力；再次感染发生的炎症发应则偏重于免疫预防，溃疡当浅而愈合，细菌不扩散，说明机体对结核杆菌已具有一定的细胞免疫力，而溃疡迅速形成。用过量的结核杆菌进行再次感染，则引起剧烈的迟发型变态反应，说明迟发型变态反应对机体不利的一面。人类的原发性肺炎结核，继发性肺结核，严重而恶化的肺结核，相当于郭霍氏现象的三种情况。(二)临床意义结核菌素试验：一般使用旧结核菌素（Old-tubercein简称OT），主要成分是结核蛋白，试验法常规使用5个单位OT（2000倍稀释0.1ml）或PPD-S0.0001mg注入受试者前臂掌侧皮内，48～72小时内出现红肿硬节直径大于5毫米者为阳性，虽有红肿但无硬结或硬结直径不到5毫米者为阴性。应注意受拭者处于原发感染早期，变态反应尚未发生，或正患严重的结核病如全身粟粒性结核和结核性脑膜炎时机无反应能力，或患其他严重疾病、用过免疫抑制剂时，结核菌素反应均可转为阴性。结核菌素试验是用来检查人体是否有抗结核杆菌的免疫力以及人体是否有抗结核杆菌的变态反应能力，有变态反应即表示有免疫力。(三)微生物学检查1、标本采集：根据结核菌感染的类型，应采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓液。(三)微生物学检查2.1直接涂片染色:用萋～纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”。如标本中结核杆菌量少时，直接涂片不易检出，应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。报告方法报告方法镜检结果报告方法镜检结果(－)末发现抗酸杆菌/300个油镜视野2＋10-99个抗酸杆菌/100个油镜视野(±)1-2个抗酸杆菌/300个油镜视野3＋1-10个抗酸杆菌/每个油镜视野*1＋3-9个酸杆菌/100个油镜视野4＋10个抗酸杆菌/每个油镜视野**:必须看100个油镜视野(三)微生物学检查2.2集菌涂片：沉淀集菌法：将标本用2%NaOH消化，置37℃30min；或高压灭菌液化后，3000r/min×30min，取沉渣涂片。漂浮集菌法：将标本用生理盐水充分稀释，再加放汽油或二甲苯0.5-1ml，振荡15-30min后，吸取泡沫和油层接界部分涂片，两者均用抗酸染色，报告方法同前述。(三)微生物学检查2.3荧光显微镜检查法:制片方法同前，用金胺O染色，镜检方法同前。3分离培养：标本预处理：咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂菌多，需用4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4处理30min，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物0.1ml接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。4动物试验:取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3