医学生物化学基本实验

医学生物化学基本实验第一节蛋白定量分析实验蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。表五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度原理干扰物质凯氏定氮法(Kjedahl法)0.2～1.0mg将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）双缩脲法(Biuret法)1～20mg多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸Folin-酚试剂法(Lowry法)5µg磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇考马斯亮蓝法(Bradford法)1～5µg考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100；SDS紫外吸收法50～100µg蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸实验一双缩脲法测定蛋白质含量【实验目的】掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。【实验原理】蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。【实验内容与方法】1.标准曲线的制作(1)取小试管7支，编号，按表2-2操作表2-2双缩脲法操作步骤试剂（ml）管号1234567标准蛋白质溶液生理盐水双缩脲试剂0.10.30.50.70.9—样品0.10.90.70.50.30.11.00.94.04.04.04.04.04.04.0(2)混匀后，于37℃水浴中保温15min，在540nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。2.样品测定取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加二缩脲试剂4ml，于37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每l00ml血清（样品）中蛋白质的克数。【实验准备】1.双缩脲试剂称取CuSO4·5H202.5g，加水100ml，加热助溶，另取酒石酸钾钠10g，碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/LNaOH300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml，此液可长期保存。2.生理盐水，标准蛋白质溶液2mg/ml3.仪器及玻璃器皿721型分光光度计，水浴箱，中试管6支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，坐标纸实验二考马斯亮兰法测定蛋白质含量【实验目的】1.掌握考马斯亮兰结合法对蛋白质定量测定的方法及原理。2.熟悉紫外分光光度计的使用。【实验原理】考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，通过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。应用考马斯亮兰法的优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1µg。（2）测定速度快、简便，只需一种试剂。（3）干扰物质少。【实验内容与方法】1.取试管3支、编号，按表2-4操作表2-4考马斯亮兰法测定蛋白质试剂（ml）空白管标准管样品管生理盐水0.1标准蛋白溶液0.1样品0.1考马斯亮蓝试剂5.05.05.02.混匀，室温放置5min，在波长595nm处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。3.计算mLgODOD/50样品中蛋白质的含量标准样品【实验准备】1.考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G-250100mg，加95%乙醇溶液50ml，使之溶解，再加入85%磷酸溶液100ml，加水至1000ml。混匀，避光放置过夜，用二层滤纸过滤，滤液用棕色瓶保存，至少可保存两周。2.标准蛋白溶液50µg/ml。3.仪器及玻璃器皿721分光光度计，试管l0支，刻度吸管10ml、l5ml、lml、0.1ml各1支，普通玻璃比色杯4只。实验三紫外分光光度法测定蛋白质含量【实验目的】1.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。2.熟悉紫外分光光度计的使用。【实验原理】蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内。吸收峰的吸光度值与其浓度成正比，可作定量测定。由于各种蛋白质中芳香族氨基酸含量的不同，因而此法适于测定与所采用的标准蛋白质的氨基酸组成相似的蛋白质，以减少误差。一般核酸在280nm波长处也有吸收，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的吸收高峰在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A260和A280，通过计算消除核酸对蛋白质的影响而算出蛋白质的含量。【实验内容与方法】1.280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。（1）标准蛋白质溶液任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用生理盐水稀释至浓度为1mg／ml。（2）取试管6支，编号，按表2-5进行操作表2-5紫外吸收法标准曲线试剂（ml）管号123456标准蛋白质溶液0.51.01.52.02.50生理盐水3.53.02.52.01.54.0混匀后，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm波长下测定各管吸光度，以各管的光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线图。（3）样品测定用生理盐水将待测样品的蛋白质浓度稀释成大约1mg／ml，取标本1.0ml，加生理盐水3.0ml，混匀，按上述方法测其A280，根据标准曲线得出蛋白质的浓度。2.260nm和280nm的吸收差法核酸对此处光有很强的吸收，在280nm处的光吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸在260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280nm/A260nm≈1.8纯核酸的光吸收比值：A280nm/A260nm≈0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280nm和A260nm，由此吸收差值，用下面的公式，即可计算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度（mg／ml）=1.45A280-0.74A260（mg/ml）3.215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成20～100µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量分别测定215nm与225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差Δ=A215nm-A225nm以吸收差Δ为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。4.肽键测定法蛋白质溶液在238nm的光吸收处的强弱，与肽键的多少成正比。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成50～500µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量测定238nm的吸光度值A238nm，以A238nm为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。本方法比280nm吸收法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用，所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。【实验准备】紫外分光光度计，坐标纸。附录：常用实验技术原理——分光光度技术分光光度技术（spectrophotography）是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，该技术灵敏度强，精确度高，操作简便、快速；对于复杂的组分系统，勿需分离即可检测出其中的微量组分，因此分光光度技术已成为生物学研究领域中广泛使用的方法之一。【基本原理】物质对光波有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，有色溶液之所以呈现出不同的颜色，是由于物质对光的选择性吸收所致，有些物质能选择性吸收特定波长的紫外光或红外光，因此，每种物质都具有其特征性的吸收光谱。分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ=1，000nm）之间。其中200nm－400nm为紫外光区，400nm－760nm为可见光区，760nm－10，000nm为红外光区。在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其吸收强度，对不同物质进行定性和定量分析。分光光度技术依据的原理是Lambert-Beer定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度和溶液厚度之间的关系。当光线通过透明介质时，溶液吸收了一部分光能，因此当光透射出溶液之后，光强度减弱。溶液浓度越大，或溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径愈长），则对光的吸收越强，光的强度减弱也愈显著。1.朗伯（Lambert）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随吸收光介质的厚度增加而呈指数减少，即lKoeII1（I0：入射光强度，Ｉ：透射光强度，l：介质的厚度）式中K为吸光系数：表示吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度，是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长决定。对于同一物质和一定波长的入射光而言是一个常数。当溶液浓度单位为mol/L，光程厚度为lcm时的吸光系数称为摩尔吸光系数，又称摩尔吸光度，用ε表示，其单位是(L·mol-1·cm-①，一般采用ε值最大的波长进行比色测定。2.比尔（Beer）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度的增加而呈指数减少。即CKoeII2（C:溶液浓度）两者结合在一起称为朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，即吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。KcloeII透光度T为I/I0，通常以百分率表示。KcloeIIT取对数kclATIIolglgoIIlg称为吸光度（A）。采用适当的光源、棱镜和适当的光源接收器，让某一波长的光透过某一溶液，通过仪器的测定，定性鉴别物质或定量测定某一组分含量的方法即为分光光度法。通过对光波长的调整，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽然不是纯的单色光，但波长范围更狭窄，更符合Lambert-Beer定律，其灵敏度大为提高。【分光光度技术的基本应用】（一）测定溶液中物质的含量可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。在实际测定过程中，可采用两种方法：（1）标准管法（标准比较法）用已知浓度的测定物（标准溶液）与待测定溶液同样处理，测定吸光度，再根据前式计算，即A1=K1C1L1；A2=K2C2L2，式中A1、A2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液的吸光度；C1、C2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液中待测物浓度。由于盛放标准液和待测液的比色杯径长相同（L1=L2），故上二式可写成：222211CKACKA因标准液和待测液中溶质为同一物质，K值相同，即：K1=K2可换算成下式：1122CAAC上式为实验操作中常用的计算式。因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故需设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收值。（2）标准曲线法先配制一系列已知