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人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测内容•HPV与宫颈癌•宫颈癌检测方法比较•HPV核酸检测方法学比较•临床使用宫颈癌妇科第二大癌症每年约有20余万妇女死于宫颈癌新发病:全球---50万/年我国---13.2万/年姓名：哈拉尔德·楚尔·豪森国籍：德国民族：日耳曼课题：发现人乳头瘤病毒（HPV）引发宫颈癌成绩：获得2008年度诺贝尔生理学或医学奖HaraldzurHausen宫颈癌什么是HPV？•HumanPapillomavirus人乳头瘤病毒•双链DNA无包膜病毒•广泛分布于高等脊椎动物•定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮HPV病毒电镜照片Circular逆转录区域包括控制病毒基因组复制的基因序列E6、E7为两种致癌蛋白编码，它们是高危型HPV导致细胞变性的主要原因E1、E2、E4和E5负责病毒复制L1、L2为两种病毒外壳蛋白编码在预防HPV的疫苗中使用了L1HPV的类型•已经鉴定的乳头状瘤病毒有200多种•与人有关的约125种•30-40种感染生殖道•低危型：HPV6、11、42、43、44等•中间型：HPV31、33、35、39、51、52、58、59、68•高危型：HPV16、18、45、56等•临床最重要的型：6、11、16、18、31、33、35、38型8个亚型HPV感染HPV感染的途径和危险因素•性传播•直接皮肤接触•母婴传播性行为混乱免疫抑制吸烟其他STD协同感染口服避孕药HPV感染率与发病率051015202515-1920-2425-2930-3435-3940-4445-4950-5455-5960-6465-HPV感染率宫颈癌发病HPV感染与宫颈癌发病率变化图，IntJCancer1993,53:919HPV感染的不同阶段0%20%40%60%80%100%120%正常人CINICINIICINIII宫颈癌4%30%55%65%99.80%宫颈癌的癌前病变(CIN)•CIN=CervicalIntraepithelialNeoplasia•宫颈上皮内瘤样病变CIN宫颈不典型增生宫颈原位癌：宫颈上皮细胞发生癌变，但癌变未突破基底膜、间质无浸润。轻度（CINⅠ级）：病变局限在上皮层的1／3内中度（CINⅡ级）：病变局限在上皮层的下2／3重度（CINⅢ级）：病变几乎累及全部上皮层，仅剩1－2层表面的正常鳞状上皮宫颈上皮细胞部分或大部分被不同程度异型细胞所替代定义宫颈癌的癌前病变(CIN)专家共识•宫颈癌的“元凶”就是高危型HPV感染•高危型HPV感染是宫颈癌的必要条件•没有HPV感染，就没有宫颈癌•防治HPV感染，就是防治宫颈癌1995年，国际癌症研究协会认为高危固定价HPV的持续性感染是宫颈癌的主要病因宫颈癌感染HPV病毒CIN早期浸润癌唯一知道病因的癌症唯一可以通过早期干预阻断的癌症内容•HPV与宫颈癌•宫颈癌检测方法比较•HPV核酸检测方法学比较•临床使用分子水平细胞水平组织水平宫颈癌检测方法学发展过程1982年醋酸、碘液肉眼检测灵敏度为70.9%特异度为74.3%1996年新柏氏TCT灵敏度为80.8%特异度为51-60%2000年HPV核酸检测灵敏度为98.6%特异度为99%巴氏涂片灵敏度为50%以下特异度为？%1941年宫颈癌筛查发展史组织学检测肉眼观察阴道镜观察组织检查优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大。细胞学检测传统巴氏涂片液基细胞学传统巴氏涂片（CV）液基薄层细胞学技术(TCT)自动细胞学检测系统（LCT）计算机辅助细胞检测系统（CCT）细胞学检测的假阴性液基细胞学检测假阴性结果高达20%水平差的地方更高原因分析：1、视野局限2、人为因素1）取标本、片子制备2）技术差异3）耐心、责任心细胞学检测的假阳性1、凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但不是特异性改变2、HPV正在清除阶段细胞学检测的性价比低TCT阴性要求每年做同样的检查HPV阴性可以把筛查时间延长到3-5年HPV检测TCT检查卫生部《宫颈癌筛查及早诊早治指南》核酸检测直接检查导致宫颈癌的元凶---HPV病毒灵敏度高，特异性好操作简便，可作为疗效评估和监测指标宫颈癌筛查三方案最佳方案：HPV核酸检测+液基细胞基本方案：醋酸白实验一般方案：HPV核酸检测+传统巴氏涂片中国癌症研究协会推荐方法内容•HPV与宫颈癌•宫颈癌检测方法比较•HPV核酸检测方法学比较•临床使用HPV第一代核酸检测产品•产品：HC2、港龙13型•原理：杂交捕获技术•特点：检测核酸、不分型、不能科学定量、检测时间长计算机判读15minDNA-RNA杂交60min抗体捕获60min化学发光检测30minDNA分解45minHPV核酸第二代检测产品•产品：凯普21型、亚能23型、透景26型、达安19型、港龙29型•原理：膜条杂交、液相杂交•特点：–可以分型，而且高低危都能做–需要杂交、时间长。5-10个小时不等。–开放式杂交、极易导致实验室生物污染。–结果需肉眼判读，增加人为误差。–不能定量HPV核酸第三代检测方法•产品：上海之江13型分型检测试剂•原理：分别采用HPV13种型别的特异性引物及荧光探针，应用PCR+Taqman技术，对HPV13种型的特异性核酸片段进行分型定量检测。•特点：分型、定量、快捷、安全优势一：分型HPV59IC高危13型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68优势二：快捷上机检测抽提DNA30min60min标本采集30min2小时！加样加试剂优势三：安全之江：封闭式实时荧光PCR无需洗涤减少污染传统膜条杂交：反复洗涤操作繁琐污染几率增加优势四：定量（唯一）3、便于文章的发表。1、宫颈病毒载量和CIN分期呈正相关。2、用于对病程的观察和疗效的评估。正常hpv正常HPV正常正常hpv正常HPV5万IU1万IU传统方法为什么不能定量？正常hpv一、标本量采集不准确。二、上皮细胞过少，也会出现假阴性的结果5万IU/10个1万IU/2个正常hpv之江的定量方法—科学1、MNBH是人单拷贝基因-----测MNBH基因的数量相当于检测取了多少个上皮细胞2、如果没有检测出MNBH基因，或MNBH量太少。可以避免假阴性结果正常hpv正常HPV正常正常hpv正常HPVHPV内容•HPV与宫颈癌•宫颈癌检测方法比较•HPV核酸检测方法学比较•临床使用HPV检测结果的用途•筛查：与细胞学检测配合确定筛查频率和周期，确保早期发现，及时干预。•分流：根据筛查结果，将高危人群和患者群进行分流，制定不同的干预、治疗方案。•随诊：根据HPV结果的变化情况，判断治疗效果和病情转归。HPV检测送检流程病人选择健康人群、高危人群、诊治人群3天内无药物和冲洗、非经期24小时无性生活无醋酸碘液涂抹标本采集暴露宫颈口清理宫颈口分泌物在宫颈口内侧逆时针和顺时针搓动宫颈刷各五圈标本送检宫颈刷头放入细胞保存液密闭，标注日期和编号2-8℃保存2周内通知送检宫颈刷、保存液及取样示意图HPV检测后处理HPV基因分型检测常规筛查液基细胞学检查根据最后结果按ASCCP指南处理阳性正常CINⅠCINⅡ、Ⅲ阴性1年后重复HPV检测和细胞学检查半年后重复HPV检测和细胞学检查或阴道镜检查阴道镜检查、多点活检HPV感染的治疗•通过治疗HPV感染达到防治宫颈病变的目的是近年来研究的热点，但目前仍缺乏公认有效的治疗手段。•30岁之前的感染者，如果没有宫颈细胞学改变，主要通过消除易感因素、提高机体免疫能力、辅助局部药物治疗，帮助感染者自我清除。•30岁以后的感染者，以及无论年龄有细胞学改变者，治疗包括：抗HPV治疗+宫颈病变治疗其中抗HPV治疗包括：全身抗病毒药物、免疫增强剂、生物学治疗、中药治疗、局部药物（抗病毒、改善内环境、促进上皮修复）治疗；现有宫颈病变治疗手段也能清除部分HPV病毒。•项目一：HPV16、18分型检测特点：1、可以分型检测2、可以覆盖70%-80%的病毒3、收费低，容易推广目标：1、常规妇科体检HPV两个项目推荐HPV两个项目推荐•项目二：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种高危型分型检测特点：1、可以分型检测2、可以覆盖99%的病毒目标：1、宫颈病变患者2、对健康有体检需求者宫颈癌是目前唯一可防可治的癌症、提高检查意识，就可以远离宫颈癌。-----谢谢大家