膜片钳技术与离子通道药理学

（Patchclamptechniques&Ionchannelpharmacology）膜片钳技术与离子通道药理学马腾飞药理教研室1991Nobel基金会的颁奖评语：膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。1、细胞电生理学3、离子通道药理学2、膜片钳技术及其应用OUTLINE细胞电生理学Electrophysiology细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动测量离子、离子通道细胞兴奋生物电信号细胞电生理学膜的“流动镶嵌模型”细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，etal.1946年）1、生物膜分子结构？2、物质转运功能？脂质双分子层、蛋白质、糖类单存扩散、易化扩散、主动转运、出入胞离子通道(ionchannels)离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：KNa100倍、兴奋：NaK10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。开放状态openstate失活状态Inactivestate静息状态restingstate激活activation失活inactivation复活recovery离子通道的特性(CharacteristicofIonChannels)配体门控通道阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体通道蛋白——离子通道乙酰胆碱受体电压门控通道：钾、钠、钙离子通道通道蛋白——离子通道电压门控钾离子通道研究技术Patch-clamp技术新药开发Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流分子生物学技术单细胞电流记录离子通道的结构与功能药物作用机制基因克隆及蛋白表达通道蛋白功能测定1、细胞电生理学3、离子通道药理学2、膜片钳技术及其应用OUTLINEPatch-clamp(膜片钳)技术探头计算机模数转换膜片钳放大器样品池单细胞K+Ca2+Na+++-电极电极--基本原理利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳实验室基本设备膜片钳放大器信号转换器倒置显微镜微操纵器防震工作台及静电屏蔽笼微电极拉制仪及抛光仪计算机专用软件细胞记录槽恒速灌流泵Electrophysiology-ApparatusFaradaycageVibrationIsolationTableMicroscopeMicro-ManipulatorsRemoteControllerAmplifiersCCDCameraElectrophysiology-ApparatusMicro-ManipulatorsDAD-VCsystemCCDCameraElectrophysiology-ApparatusElectrophysiology-ApparatusPatchclamp膜片钳记录的基本步骤可概括为4大部分：1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当根据不同的研究要求而相应选择。3.膜片钳记录4.资料分析用相应的计算机软件进行膜片钳记录电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在0.5-2.0μm之间，是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压，在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆封接就必须做到：1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅；4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之；5)细胞膜清洁，活性好。资料分析一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭(flickering)，化学门控性通道的开、关速率常数等。药理学研究：研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。综合分析得出最后结沦．膜片钳技术的优点膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。膜片钳记录的各种模式根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主要分为４种模式。首先建立的单通道记录法（Singlechannelrecording）是细胞吸附式，其后又建立了膜内面向外和膜外面向外的模式；还有一种是全细胞记录法（Ｗholecellrecording）的全细胞式。现在又发展了开放的细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式，以及穿孔膜片的模式。Patchclamp-wholecell细胞吸附膜片(cell-attachedpatchmode)一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录的模式。优点是不破坏细胞的完整性,内环境保持正常。缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面。内面向外膜片(inside-outpatch)在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down（或run-up）现象。外面向外膜片(outside-outpatch)在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。全细胞记录式(Ｗhole-cellrecording)在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘。这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。开放细胞吸附膜内面向外模式（opencell-attachedinside-outmode）将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。穿孔膜片模式（perforatedpatchmode）为克服全细胞模式的胞质渗漏问题，Horn和Marty将与离子亲和的制霉菌素（或二性霉素Ｂ）经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforatedvesicleoutside-outmode)穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离子通道。膜片钳技术的应用分辨单通道电流,直接观察通道的开闭过程;区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道),发现新的离子通道及亚型;在记录单个通道电流(ｉ)和全细胞电流(Ｉ)的基础上,可分别计算出细胞膜上的通道数(ｎ)和开方概率(ｐ),依公式Ｉ=ｎｉｐ;用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片);研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶Ｃ等活性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片);研究受体的激活态、失活态和静息态的功能；研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。研究药物对电压和化学内控性通道的影响。Neher等首创将膜片钳技术与Fura2荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。Neher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,进而可以定量研究钙离子浓度与分泌率的关系及最大分泌率等指标。膜片钳技术与其它技术相结合Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用,可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术,膜通道蛋白重建技术。膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革命性意义，而且开辟了一条探索药物作用机制和发展新的更为有效药物的途径。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。膜片钳在药理学研究中的应用膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。膜片钳技术对离子通道的动力学研究以及药物与通道相互作用机制的研究。药物对通道电压依赖的激活和灭活过程的影响药物对离子通道状态依赖性的作用（如大多数Ⅰ类抗心律失常药与失活状态的Na+通道结合而发挥作用）。药物的频率依赖性（frequency-dependent）或使用依赖性（use-dependent）（如维拉帕米）以及药物对离子通道亚型的选择性作用等。药物作用机制研究膜片钳技术还在作用于通道活性受体和第二信使调节的药物的机制研究中发挥了重要作用。如证明了肾上腺素能介质及药物激活β受体后，通过第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使钙通道磷酸化，由关闭状态转为开放。新药开发在现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创制的前提。随着膜片钳技术运用对许多新受体亚型的发现和特性研究，新型受体阻断剂将在选择性、高效性上发挥更大的作用。近十年来药物学研究最重要的成就之一就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和维拉帕米及其衍生物)。研制出钾通道开放剂（nicorandil、pinacidil等）Ⅲ类抗心律失常新药是近年来心血管药理的重要研究方向。离子通道病及与离子通道调节缺陷有关疾病的研究。将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常