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血清学实验《临床微生物学检验》实验医学检验技术教研室血清学诊断：是指用已知细菌的特异性抗原检测患者血清中相应抗体的方法，以诊断感染性疾病。（用已知抗原检测血清中的特异性抗体）血清学鉴定：即采用含有已知特异性抗体的免疫血清（诊断血清）与分离培养出的未知纯种细菌或标本中的抗原进行血清学反应，以确定病原菌的种或型。（用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原）微生物抗原成分-----细菌抗原成分菌体抗原:革兰氏阴性菌的菌体抗原称O抗原---脂多糖蛋白质的复合物鞭毛抗原称为H抗原表面抗原:不同细菌的表抗原名称不同.大肠杆菌的表面抗原称为封套抗原或K抗原,肺炎双球菌的叫荚膜抗原,伤寒沙门氏菌的表面抗原称为Vi抗原细菌抗原细菌的各种抗原抗原抗体反应抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（erologicreaction）。抗原抗体反应条件1.抗原2.抗体3.环境因素：（1）电介质：0.85%NaCI；（2）温度：37或56（3）pH值：7.0（4）振荡：适当的机械振（5）反应时间抗原抗体反应的特点特异性和交叉性若两种抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高。反应的可逆性抗原与抗体的结合为分子表面的结合，结合的适宜温度为0～40℃、pH在4.0～9.0范围内。如温度超过60℃或pH降到3.0以下，或加入解离剂台硫氰化钾、尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的抗原或抗体性质不改变。抗原抗体反应特点最适比和带现象只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称为带现象。抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出现的抑制现象称后带现象。为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或抗体作适当稀释。抗原抗体反应特点反应的二阶段性结合阶段-----反应发生快，几秒钟至几分钟。反应阶段-----较慢，需几分钟、几十分钟或更长时间。凝集反应颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见的凝集小块。凝集原——凝集素直接凝集反应玻片法试管法抗原抗体反应类型-----凝集反应血清学鉴定掌握细菌的血清学鉴定法。实验目的实验原理根据抗原抗体反应具有高度特异性的特点，用已知抗体来检测未知抗原（细菌）。实验材料1.菌种待检细菌2.试剂多价沙门菌O(A-F)诊断血清3.其他载玻片沙门氏菌诊断血清（11种）O2O4O7O9HaHbHcHdHiViA-F群多价OA-F群多价OO抗原、H抗原和Vi抗原O抗原:是一种沙门氏菌细胞壁表面的耐热多糖抗原，100℃，2.5h不被破坏，它的特异性依赖于细胞壁脂多糖侧链多糖的组成。H抗原:是一种蛋白质性鞭毛抗原，共有63种，60℃加热30～60min及酒精作用均可破坏其抗原性，但能抵抗甲醛。Vi抗原:是一种N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，60℃加热1h即破坏其凝集性和免疫原性。沙门氏菌的主要抗原组成O抗原：至少58种,含相同抗原组分归为一组，引起人类疾病的沙门菌大多数在A~F组。H抗原：分为Ⅰ、Ⅱ相，Ⅰ相以a、b、c等表示，Ⅱ相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不稳定，可阻止O抗原与其相应抗体的凝集反应。沙门氏菌菌型的表示方法血清型以数字和字母表示.例如:查考夫曼-怀特沙门氏菌属抗原表.鼠伤寒沙门氏菌:O抗（1，4，[5]，12），第Ⅰ相H抗原（i）第Ⅱ相H抗原(1,2)。它的血清型应表示为:鼠伤寒沙门氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）[]内的O抗原可能存在或不存在。[]内的H抗原可能是罕见的，正常情况下一般不存在。沙门氏菌的血清鉴定的方法用O、H和Vi因子血清与待检的菌株作玻片凝聚试验。1.先用O因子血清确定菌株所属的O群及O抗原的各种成分。2.再用H因子血清检查其第1相和第2相的H抗原以确定血清型。3.必要时还要用Vi血清检查(目前有3种)。1.先用A~F多价O血清检查，确定菌株是否在A~F六个O群的范围内。2.再用代表六个O群的O因子血清检查，即O2（A）、O4（B）、O7（C1）、O8（C2）、O9（D）、O3，10（E）、O11（F）。3.确定O群之后，分别用HA(a、b、c、d、i、z10、z29）HB、HC、HD四种多价H血清检查。4.用3.所确定的多价H血清所包括的所有H因子血清逐一检查定为第1相或第2相H抗原。5.检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原，或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，要用位相变异的方法再检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。6.综合O和H因子血清以及Vi因子血清的检查结果，按照考夫曼-怀特沙门氏菌属抗原表解判定沙门氏菌的菌型。沙门氏菌的血清型鉴定步骤实验方法50ul血清+待检菌50ulNS+待检菌先用A－F和Vi血清检测，根据结果再进行其他鉴定。注意：结果判断均匀混浊颗粒状凝集物＋－组别菌型抗原oHA甲型副伤寒沙门菌1,2,12a:-B乙型副伤寒沙门菌德比沙门菌鼠伤寒沙门菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C猪霍乱（或丙型副伤寒）沙门菌6,7,(Vi)c:1,5D伤寒沙门氏菌9,12,Vid:-E鸭沙门氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙门氏菌11i:1,2沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表注意事项1.生理盐水端应不出现凝集颗粒。2.沙门菌Vi抗原存在时可阻止O抗原与相应抗体发生凝集，故在做玻片凝集时应加注意，需事先加热破坏Vi抗原，O抗原才得以与相应的O诊断血清发生凝集。血清学实验进程先鉴定A－F和Vi，根据结果再进行其他鉴定。A－FVi实验进程--为非沙门氏菌属，不再继续鉴定其他抗原成分。+-初步判断为沙门氏菌属，继续鉴定其他抗原成分。-+初步判断为沙门氏菌属，但需去除菌体Vi荚膜后再继续鉴定其他抗原成分。群别菌型抗原oHA甲型副伤寒沙门菌1,2,12a:-B乙型副伤寒沙门菌德比沙门菌鼠伤寒沙门菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C猪霍乱（或丙型副伤寒）沙门菌6,7,(Vi)c:1,5D伤寒沙门氏菌9,12,Vid:-E鸭沙门氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙门氏菌11i:1,2沙门氏菌属常见菌型诊断抗原表位相变异的解释将一个双相沙门氏菌的菌株在琼脂平板上划线分离，所得的菌落中，有的有第1相H抗原，有的则有第2相H抗原。若任意挑取一个菌落在培养基上多次传代，其后代又可出现部分是第1相而另一部分是第2相的菌落。这种两个相的H抗原可以交相产生的现象称为位相变异。双相菌初次分离时，单个菌落的纯培养往往只有一个相H抗原，鉴别时常只能检出一个相，而测不出另一相。此时，可用已知相血清诱导的位相变异试验来获得未知的另一个相H抗原。位相变异试验的方法简易平板法1.配制0.7~0.8%的半固体琼脂培养基，然后倾注平板烘干表面水分。2.在平板内滴上一滴已知的第1相或第2相血清因子，并作好标记。3.待血清吸收到琼脂内，在标记部位的中间点种已知第1相或第2相的新鲜待检菌株。4.培养后，其已知相细菌的动力受到抑制，解离出另一相的细菌，并向周围蔓延生长，形成一个大的菌落。5.检查其菌落的边缘部分，即可确定该菌株的另一相H抗原。6.该方法通常1~3天内可以有结果。位相变异试验的方法U形管法小玻管法小套管法软琼脂斜面法59种沙门氏菌的血清列表O1O2O4O5O7O8O9O10O11O14O15O19O20O27O34O46O3,19HaHbHcHdHfHgHhHiHkHmHnHpHrHsHtHuHvHwHxHyHzHz6Hz10Hz13Hz15Hz28Hz29H2H5H6H7HehHgpHlvHAHBHCHDViA-F群多价OA-F群多价OHenxH1.2.3.5血清学实验材料分配分组4人/组菌种待测菌种一支诊断血清1盒/组写实验报告写明实验判定结果（即阴性或阳性），并描述整个实验过程及注意事项。