限制性内切核酸酶消化DNA及从琼脂糖凝胶中回收DNA

PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收限制性内切核酸酶消化DNA限制性内切核酸酶（restrictionenzyme)是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。限制内切酶切出的三种断口在酶切实验中：如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。如果用同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。用两种不同的限制酶共同切割载体和插入片断，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是BamHI和HindIII，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。酶切体系PCR产物0.5μgBufferK（10X）5μlddH2O加至48μlBamHⅠ（20U/ul）1μlHindIII（20U/ul）1μl总体积50μl将酶切体系按顺序加好后柔和混匀，放入已预热的37℃的水浴锅（或37℃培养箱）中，使反应体系在这个温度下进行酶切。在酶切实验中需要注意的事项1反应Buffer2酶切位点的保护碱基3酶切反应温度4酶切体系的体积每一种酶都具有相应的反应缓冲液，反应缓冲液可能相同也可能不同。一般同一公司的酶的缓冲液可以通用，不同公司的一般不相同。若不同酶使用相同的缓冲液，则可同时加入，若使用不同的缓冲液，则只能在第一个酶切完成后，进行酚抽提，乙醇沉淀，再进行另一个酶的消化。保护碱基限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱基是在设计PCR的引物时加入的。BamHⅠ的保护碱基ATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGAHindIII的保护碱基ACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC酶切反应温度３７°C对于大多数酶来说是最佳反应温度。实验中应注意反应的温度。在我们的实验中使用水浴锅提供酶反应的温度，但是由于水浴锅中离心管底部的温度与管顶的温度不同，易造成反应体系的蒸发，这样会造成酶反应条件的改变，可能会造成酶产生星活力。因此，如酶反应时间较短，在两小时左右，可在水浴锅内进行，如时间较长，最好在培养箱内进行反应，可避免水分蒸发和凝结。25°C37°C酶切体系的体积我们今天的酶切体系是50μl。在反应中加入的酶量不能超过总体积的十分之一。并不是在酶切中加入的酶越多越好，因为在酶的储存液中含有甘油，甘油可以保护酶，防止酶结冰，失去活性。而当甘油达到一定的浓度，（在反应体系中〉10%），就会影响酶，产生星活力，切割出我们不需要的片段。星号活力又称为第二活力，是指改变了酶切反应条件后特意序列的识别特性降低的一种现象。由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割。如EcoRⅠ的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。高浓度甘油、高PH、低离子强度、DMSO、β-巯基乙醇、Mn2+等的存在可能导致酶产生星活力。2.相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilusinfluenzae)的HindII和HindIII。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。1)寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型*Ⅲ型第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键。如EcoRI的识别顺序为：5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。粘性末端：II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：3）II类限制修饰酶命名规则：生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称基本名称+菌株名的字母+罗马字母（发现顺序）HindIIIHaemophilusinfuenzaed株中的第三个酶EcoRI基因位于Escherichiacoli抗药性R质粒上EcoRI细菌属名细菌种名种菌株类型有几种限制酶同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G|CGG……3’3’……GGC|G……5’如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。同尾酶：如BamHI和BglII:5‘…G|GATCC…3’5‘…A|GATCT…3’3‘…CCTAG|G…5’3‘…TCTAG|A…5’5‘…GGATCC…3’5‘…AGATCT…3’3‘…CCTAGG…5’3‘…TCTAGA…5’5‘…GGATCT…3’3‘…CCTAGA…5’这些粘性末端连接后，BamHI和BglII酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。3.酶切反应的设计一般应注意问题:①大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度过高时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。②酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。③反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。④反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。⑤当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。4.酶切实验中的注意事项:1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在室温的放置时间。2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。4)终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。从琼脂糖凝胶中回收DNA在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段具有和目的片断同样的黏性末端，也可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。离心柱法回收凝胶中的DNA1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条置于1.5ml离心管中；2.加入3体积溶胶液，50~60℃数分钟直至无可见凝胶块；3.冷却至室温；4.加入到离心吸附柱中，室温放置1min后，5000～10000rpm1~5min使液体滤过；倒掉离心管中液体；5.向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm2min洗涤一次；倒掉离心管中液体6.向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm2min洗涤一次；倒掉离心管中液体；7.将离心柱放入离心管中12000rpm2min；8.将离心柱放入新的1.5ml离心管中，向离心柱中滤膜上加入20~30ul洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心3min，液体中即为回收的核酸。注意事项电泳所用的胶的浓度为0.7%，易于回收核酸。溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。