限制性核酸内切酶

2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide1基因工程GeneEngineering授课课时:32学时，考试方式:笔试上课地点:S1406（3-19周第3周开始)任课教师:李晓玲博士，办公室，M1621联系电话:[phone],[e-mail]2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide2课程要求•通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。•总成绩＝平时（20％）＋测验（30％）＋考试（50％）•平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面)2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide3教材和参考文献1.楼士林等，基因工程，科学出版社，20022.吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，19983.张惠展编著，1999年出版，《基因工程概论》，华东理工大学出版社。4.Watson,J.Detal.RecombinantDNA,W.H.FreemanandCompany,NewYork,2ed,19925.RobertF.Weaver,MolecularBiology,科学出版社,2000（影印版）2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide4本课程内容•第一章绪论•第二章基因克隆的工具酶•第三章基因工程的载体•第四章目的基因的制备•第五章目的基因导入和重组子的筛选•第六章外源基因的表达•第七章基因操作的基本技术•第八章植物基因工程及应用•第九章动物基因工程及应用•第十章医学基因工程及应用2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide5第二章基因工程的工具酶2.1核酸酶2.2甲基化酶2.3连接酶2.4聚合酶2.5修饰酶2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide62.1核酸酶限制性核酸内切酶2.1.1限制性核酸内切酶的类型2.1.2限制性核酸内切酶的命名法2.1.3限制性内切酶的识别序列2.1.4限制性内切酶的切割位点2.1.5限制性内切酶的切割方式2.1.6限制性核酸内切酶的反应体系2.1.7限制性核酸内切酶的星活性2.1.8限制性核酸内切酶对DNA的消化作用2.1.9限制性核酸内切酶酶切注意事项2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide7•几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。•酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。•Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。•定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide8限制性内切酶（Endonucleosase）的发现•50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsdR,hsdM,hsdS,十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理：hsdR---限制性内切酶hsdM---限制性甲基化酶hsdS---控制两个系统的表达2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide9•1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定了基础。截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide10限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)概念：•是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。•是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，防止外源DNA的入侵。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide112.1.1限制性核酸内切酶的类型•三类：I型、II型、III型。•I类：最早发现，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。3个亚基：HsdS－识别特定DNA序列HsdM－甲基化HsdR－限制性内切酶功能三个亚基组成复合体，全酶才有活性。biochemistry：needATP,Mg++,longsequences(1000-5000nt),atrandomunspecial,can’tbeusedingeneticengineering2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide12•III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。•2个亚基组成：HsdM－甲基化HsdR－限制性内切酶功能•需要ATP、Mg2+，类似于I应用同样受限制。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide13•II类：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件具有两个亚基：HsdM－甲基化HsdR－限制性内切酶功能切割特异2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide142.1.2限制性核酸内切酶的命名法•用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,II,III等。如：Escherichiacoli用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：HindIII从流感嗜血菌株（HaemophilusInfluenzue）d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide15derivation：firstthreenamesfromthelatinnamesofthemicroorganismthatproducesthem.firstletter(genus),nexttwoletters(species)writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide162.1.3限制性内切酶的识别序列•识别序列指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列•专一•通常4～6个特定的核苷酸对组成•迴文结构(palindromicsequence)或旋转对称或二重互补对称2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide17recognitionsequence:cleaveDNAsymmetricallyinbothstrandsatshortpalindromic(symmetrical)recognitionsequencestoleavea5’-phosphateanda3’-OH.Theyleavebluntends,orprotruding5’-or3’-termini.EcoRⅠ:↓*5＇GAATTC3＇3＇CTTAAG5＇*↑recognitionsequenceenzymes5＇GTTAAC3＇HpaⅠbluntend3＇CAA↓TTG5＇5＇G↓AATTC3＇EcoRⅠ5’protrudingend3＇CTTAA↑G5＇5＇A↓AGCTT3＇HindⅢ5’protrudingend3＇TTCGA↑A5＇5＇G↓GATCC3＇BamHⅠ5’protrudingend3＇CCTAG↑G5＇5＇CTGCA↓G3＇PstⅠ3’protrudingend3＇G↑ACGTC5＇2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide19识别序列在DNA上出现的概率•1/4n（n＝识别序列核苷酸组成的数目）Sau3A4碱基酶,则每隔256(44)bp会出现一个识别位点。EcoRI、PstI6碱基酶，则每隔4096(46)bp会出现一个识别位点。•NotI(8bp)=1/4865536，稀切酶（rarcutters）:指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核酸内切酶。•仅是理论推测2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide20•同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamHI和BstI具有相同的识别序列GGATGC•同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：–BamHI识别序列：GGATCC–BglII识别序列：AGATCT2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide21•远距离裂解酶(distantcleavage)：识别位点与切割位置不一致。如：FaqIGGGAC(10/14)•5'-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-3'•3'-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3'•可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：BseJIGATNNNNATC•Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：EheIGGCGCC•Hin6IGCGC2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide222.1.4限制性内切酶的切割位点•切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。•一般在识别序列的内部或两侧附近。•以或表示。•环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得到n个DNA片段。线性DNA分子，则会得到n+1个DNA片段。RestrictiondigestsdigestionofplasmidorgenomicDNA,foranalyticalorpreparativepurposes,usingcommercialenzymesandbuffersolutions.AllRErequireMg2+,usuallyataconcentrationofupto10mM,butdifferentenzymesrequiredifferentpHs,NaClconcentrationsorothersolutionconstituentsforoptimumactivity.2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide242.1.5限制性内切酶的切割方式•交错切割（staggeredcut）:DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。如：BamHI-GGATGC--CCTACG-•平切割：DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。如：NsbITGCGCA2/29/20205:58:17PM欢迎2011级生物科学班同学们听课！Slide25粘性末端和平末端•粘性末端(cohesiveterminus/stickyends)：DNA末端