搜索
实验目的观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。实验原理细胞骨架包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。实验用品㈠器材：显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子㈡试剂：⒈M—缓冲液;50mmol/L咪唑，50mmol/LKCL;0.5mmol/LMgCL2,1mmol/LEGTA(乙二醇双（a-氨基乙酸）醚四乙酸），0.1mmol/LEDTA,1mmol/L巯基乙醇或DTT(二硫酥糖醇）⒉6mmol/LPH6.8磷酸缓冲液。⒊1%TritonX-100，用M—缓冲液配。⒋0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂是甲醇46.5ml,冰乙酸7ml,蒸馏水46.5m.⒌3%戊二醛，用6mmol/L磷酸缓冲液（PH6.8)配制。⒍5%、7%、95%乙醇。⒎叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。㈢材料：洋葱鳞茎。试剂的作用细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。各个试剂的作用PBS是生物学常用的缓冲液，可以依照不同的用途配成不同pH值的，实验所用的PBS的渗透压与植物细胞相近，不会造成细胞的吸水或失水，影响细胞状态，进而影响实验结果。第一步一般都是洗，主要是冲去灰尘或其他颗粒，另外稀释样品处理时渗出的植物汁液（比如用洋葱的话，撕皮的时候皮上也许多少会有沾点洋葱汁），这些汁液里面成分复杂，有可能影响后面的试剂效能，所以先用PBS洗一次。M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。考马斯亮蓝R250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。实验方法㈠取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm^2大小）若干片温于装有PH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。㈡吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20-30分钟。㈢吸去TritonX-100，用M—缓冲液洗三次，每次10分钟。㈣3%戊二醛固定0.5-1小时（对照组开始处理）㈤PH6.8磷酸缓冲液液洗三次，每次10分钟。㈥用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。㈦用蒸馏水洗1-2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。㈧如作永久制片，可使样品顺序通过如下试剂：50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇，95%乙醇和叔丁醇混合液（1:1），每次5-10分钟，或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯，每次5-10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。植物细胞骨架微丝结构图植物细胞骨架微丝结构图植物细胞骨架微丝结构图植物细胞骨架微丝结构图植物细胞骨架微丝结构图谢谢大家！