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第四节细胞实验技术一、细胞计数及活力测定方法–培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。–总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，•由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。•复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。•利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue(台盼蓝)染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。•现在也有PI和Hochst，PI不能透过活细胞膜，但是Hochst可以。•方法–血细胞计数板–流式细胞仪细胞密度（个/ml）＝（4个大格细胞总数/4）×104（10的4次方）每个大正方形之体积为1.0x10-4ml注意：1，压线的细胞记上不记下、记左不记右2，抱团的细胞记成一个3，抱团的细胞超过10%需重新打散后再记•细胞计数板获得的细胞数目的结果是大概的值，要想绝对计数需要使用流式细胞仪。流式细胞仪（flowcytometer）•流式细胞仪是对悬浮状态的细胞逐个计数并记录其有关参数的细胞分析仪器,因其测量速度快,在很短时间内可以分析大量细胞,并能测出多个参数,在临床上有广泛的应用•流式细胞仪能测量细胞的五个参数：前向角散射光（FSC）、侧向角散射光(SSC)、绿色荧光、黄色荧光、和红色荧光。FSC和SSC是细胞对激发光的散射信号,分别反映了细胞的大小和细胞的粒度。细胞越大,胞内颗粒越多,则FSC和SSC越强.原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。二、培养细胞生长曲线的绘制和分裂指数的测定•生长曲线–一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。–以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。二、培养细胞生长曲线的绘制和分裂指数的测定•生长曲线绘制方法-计数法1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数2．根据细胞计数结果按每瓶5×104／ml作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。3．24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。二、培养细胞生长曲线的绘制和分裂指数的测定•分裂指数的测定–体外培养细胞生长、分裂、繁殖的能力，可用分裂指数来表示。–分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。•分裂指数的测定方法1、消化细胞，将细胞悬液接种至内含盖玻片的培养皿中。2、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。3、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。5、计算:分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%接种细胞到盖玻片固定染色镜检三、细胞核型分析•目的–基因物理定位–遗传疾病诊断–亲缘关系判定–细胞是否异常三、细胞核型分析•操作–中期细胞的获得：•培养的细胞或者组织中分离的细胞–低渗：Kcl–固定：甲醇：冰乙酸（3：1）–滴片–染色–镜检–分析或计数核型模式图四、细胞周期的测定•原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。•方法：BrdU法。Gimsa主要染AT，而BrdU可替代T，DNA复制渗入入BrdU后会是染色变浅•BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。第一个周期：两天染色单体都深染第二个周期：一条染色单体深染一条浅染第三个周期：则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅先做同步化处理操作步骤：1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。4、常规染色体制片5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。6、弃去2×SSC液，流水冲洗。7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。9、计算：细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）五、免疫组织化学技术•免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。•按照标记物的种类可分为：–免疫荧光法、–免疫酶法，–免疫铁蛋白法–免疫金法–放射免疫自影法等。•免疫荧光法可分为以下三种–1．直接法用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。–2．间接法先用一级抗体（特异性抗体）与相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的二级抗体（间接荧光抗体）与一级抗体相结合，形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏。–3．双重免疫荧光法在对同一组织细胞标本上需要检测两种抗原时，可进行双重荧光染色，即将两种特异性抗体（例如抗A和抗B）分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗明达标记发出橙红色荧光，将两将荧光抗体按适当比例混合后，加在标本上（直接法）就分别形成抗原抗体复合物，发出黄绿色荧光的即抗A抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B抗体结合的部位，这样就明确显示两种抗原的定位。•标记的二抗是抗某个物种球蛋白抗体，有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，二抗是普适抗体，用于该物种所有一抗。间接法间接法一抗和二抗的选择：通常选择异源抗体，比如，检测的是小鼠一抗：大鼠，兔，羊（一抗是特异的抗体）二抗：X抗大鼠、X抗兔、X抗羊（普适抗体）胚胎干细胞Oct-4staining免疫双标二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择组织：大鼠一抗：A（小鼠抗大鼠），B（兔抗大鼠）二抗：AB（羊抗兔）这种是最常见的，也是最简单易行的。此时做荧光双标较理想，如二抗A选择羊抗小鼠的Cy2(绿光),二抗B选择羊抗兔的Cy3（红光）。一般来说，此种情况下，两个一抗可以一起孵育，两个二抗也可以一起孵育。封闭液就选择针对二抗的羊血清。一般是用10%normalgoatserum30min37度。这种情况选羊的或者驴血清都可以。1.免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2.封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液免疫荧光基本实验步骤：（1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，（2）固定。通常用多聚甲醛固定细胞。固定的目的除去防碍抗原-抗体结合的类脂，多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构。（3）通透。通透通常选用TritonX－100。通透剂一般都是去垢剂，它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。，通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min.（4）封闭。封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，通常使用BSA（5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。（6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。•常用的荧光素–异硫氰酸荧光素（fluoreceinisothiocyante，FITC），分子量为389，最大吸收光谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。–四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnineisothiocyante，TRITC）是罗达明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn,呈橙红色荧光，与FITC发射的绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。•免疫荧光法优缺点–优点：具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。–缺点：由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。核染色•实验室常用的核染色剂有两种–PI:碘化丙啶（propidiumiodide）,不能通过细胞膜，所以活细胞不能被染色，发红色荧光–Hochst33342和Hochst33258•两种能穿过细胞膜，发蓝色荧光，可以染色活细胞和固定的细胞•Hochst33342有更强的亲脂性，更容易穿过细胞膜•支原体检测通常用Hochst33258–DAPI:dihydrochloride•可穿透细胞膜的蓝色荧光染料DAPI染色的细胞核PI染色Hochst染色的细胞用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,PI染色(激光共聚焦显微镜照片)生物论坛,六、细胞器的分离•分离亚细胞组分的方法–差速离心：（differentialcentrifugation）–密度梯度离心：（densitygradientcentrifugation）•差速离心在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀•在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。•由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。•差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。•密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。•这类分离又可分为等速度沉降和等密度沉降平衡两种。A等速度沉降，B等密度沉降•密度梯度离心•等速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。•等密度沉降（isopycnicsedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细