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微生物标本采集、运送及处理主要内容1.前言2.标本采集的要求及原则3.标本的正确采集①血、骨髓、静脉导管②呼吸道标本③泌尿道标本④消化道标本⑤生殖道标本⑥化脓和创伤标本⑦穿刺液标本⑧眼、耳、鼻、咽拭子标本⑨组织标本⑩结核菌培养4.厌氧菌培养的采集及处理5.支原体培养正确的微生物学检验始自正确的标本采取失误的不同分布分析后阶段分析阶段分析前阶段55%41%4%标本规范化采集的重要性正确采集、处理与运送细菌培养的标本直接关系到致病菌培养的正确性与阳性率的高低，是临床细菌检验成功的关键。标本质量的好坏直接影响诊断结果的正误，不当的标本可导致假阴性、假阳性结果的出现，因此标本采集与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础。好的微生物检验标本可提升实验室工作效率及病患照顾质量，降低医疗成本。微生物样本采样基本原则1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.采样后立即送检甚至床旁接种尤其是厌氧培养5.棉拭子标本宜用运送培养基6.混有正常菌群污染标本，不可置肉汤培养7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂8.送检标本应注明来源和检验目的标本管理安全：1.所有标本采集和处理过程应无菌操作，防止污染原则下认真进行；工作人员应做好个人防护如戴手套、口罩，穿防护服，如有需要则要求戴防护眼罩。2.所有标本都应置于防漏、密封、不易破损的无菌容器中运送，条码上应清晰注明标本的所有资料，并在规定时间内安全送至微生物室。3.不能以带针头的注射器直接运送标本送至实验室，应将标本移至无菌容器中，密封后送检。4.已渗漏的标本拒绝接收。标本的采集和选择的基本要求：1.选择准确的解剖部位、合适的时间、适当的设备采集标本；2.采集足够量的标本，以保证检测的阳性率；标本运送的基本要求：1.所有常规性细菌学检验的标本需在采集后2h内送至微生物室，若延迟送检，应放于安全防护盒内；脑脊液应在15分钟内送到；2.尿液标本置于2-4℃冰箱保存不能超过24h；3.疑似苛养菌感染的标本立即保温送检。微生物标本的保存储存环境标本来源4℃冰箱尿液、痰液、粪便35℃温箱脑脊液细菌培养标本室温眼、耳、鼻、咽、血管导管、组织、体液、生殖道、厌氧菌培养标本、血液培养瓶指甲，头发，皮肤刮取物培养标本标本收集部位非无菌部位无菌部位眼血液耳脊髓液呼吸道胸膜液消化道腹膜液泌尿道关节液皮肤毛发无临床意义的标本在有正常菌群出现的感染部位（皮肤、粘膜、消化道和上呼吸道），可能会出现正常菌群过杂、过度生长，掩盖真正的病原菌，这类标本建议临床重取替代标本或说明不处理的原因。标本类型替代标本及建议烧伤或伤口拭子可重取组织或抽取物牙周损伤拭子或直肠周围拭子可重取组织或抽取物溃疡拭子或坏疽损伤拭子可重取组织或抽取物压疮拭子可重取组织或抽取物新生儿的胃抽取物不处理呕吐物或恶露不处理结肠造口术排出物不处理一、血、骨髓、静脉导管标本（一）血培养检测采血指征临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者1.发热（≥38℃）或低温（≤36℃）2.寒战3.白细胞增多（10×109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞增多）4.粒细胞减少（成熟的多核白细胞1×109/L）5.血小板减少6．皮肤粘膜出血7．昏迷，休克、多器官衰竭8CRP升高在评估可疑新生儿败血症时，除发热或低烧外，很少培养出细菌，应该补充尿液和脑脊液培养。对入院危重感染患者未进行系统性抗菌药物治疗之前，应及时采集血培养。骨髓炎或长期使用抗菌药物者骨髓培养阳性率高于血培养。（二）血培养检测消毒程序1.皮肤消毒程序：严格执行三步法（防止皮肤寄生菌污染）（1）用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上；（2）然后用1%-2%碘酊作用30秒或10%碘伏作用60秒，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上；（3）最后用75%酒精脱碘，待酒精挥发干燥后采血。新生儿及对碘过敏的患者，只能用75%酒精消毒60s，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。2.培养瓶消毒程序：（1）用75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞，作用60秒。（2）用无菌纱布或无菌棉签清除橡皮塞表面剩余的酒精，然后注入血液。。无论采用何种采血方法，血培养可接受的污染率通常是≤3%。1.严格无菌操作，避免被体表或腔道正常菌群污染；2.不要和血气、血沉的取血同时进行；3.穿刺点消毒不使用低效消毒剂，切勿在静滴的静脉处取血；4.不宜从静脉导管或静脉留置口取血，若从该部位取血，应在申请单上注明；最好同时静脉取血，以求进行比对；5.不推荐静脉血直接入瓶，以免血量控制不好或对患者不利；6.不主张换针头入瓶，以免增加污染的机会。7.采血前把血培养瓶从冰箱拿出后，待恢复至室温后采集，采集后切勿放回冰箱。（三）血培养标本采集和运送1.采集时间患者出现寒战、体温升高前；使用抗菌药物前；患者已使用抗菌药物的情况下，若出现明显的发热前期症状，可在寒战前或寒战后1h内采血；若无明显的寒战阶段，应在第二次服抗菌药物前采血；对于无明显感染病灶或未找到发热原因的发热患者，先在不同部位采集2-3份血标本，间隔大于或等于1h，24h-36h后再次采集2份以上；疑似沙门菌感染的患者在病程第1-2周采集静脉血；建议：同时采集2-3瓶；需氧菌、厌氧菌各一份，采集后同时送检；在采血后的2-5天无需重复采血培养；2.采集部位要求：从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。至少做到“双侧双瓶”。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。不建议采集（1）动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大；（2）静脉留置导管，因其常伴有高污染率。所谓“双瓶双侧”，是指从一个部位采血接种一套培养瓶，再从另一部位采血接种另一套培养瓶。（通常是双臂）所谓“双侧双瓶”，是指从一个部位采血接种一个需氧瓶，再从另一部位采血接种另一个厌氧瓶。一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养。3.采集次数要求：对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者，推荐同时采集2~3套（不同部位）血培养标本。（即双瓶双臂同时采集血培养标本。）婴幼儿患者，推荐同时采集2次（不同部位）血培养标本。为什么要求多次采血？（1）菌血症有“持续性”和“暂时性”之分，多次采血可提高阳性检出率，减少漏检；多次培养出“共生菌”，则可以确定为感染的病原菌；出现多种细菌在排除污染可能后，可考虑“复数菌”败血症的诊断。（2）血液感染有原发性和继发性之分，多次采血培养有助于循环外感染部位的诊断；（3）菌血症患者多数为间歇性，病原菌周期性出现在血液中，在无菌时期不管临床症状经历的严重程度，患者血液中的病原菌浓度水平相当低，因此要求多次采血，但24h内一般不超过3次。4.采血量要求：成年患者推荐的采血量为每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。婴幼儿患者推荐的采血量为每瓶不少于2ml。说明：血标本采集的量是影响检出率的最重要的因素。成人血培养采血量在2~30ml之间，病原菌检出率与采血量成正比例增长。每增加1ml的血液，病原菌的检出率增加3.2%。儿童患者因为血液中病原菌浓度较高，血培养量无需等同于成人。对血液病患者或者血容量相对较低的患者建议使用儿童瓶来减少血液的采集量增加病原菌的检出率。5.血培养标本的运送要求：（1）采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室。（2）血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏和冷冻。血液标本的处理1.自动化血培养系统：立即放入仪器内，直到仪器报警提示阳性瓶后进行下一步操作。2.传统血培养瓶：放入35℃温箱孵育，每日观察，若有生长情况立即转种，若第7天仍无菌生长，需要进行末次接种。双相培养瓶二.导管相关性血流感染的标本培养导管相关性血流感染：最常见的为血管内导管相关性血流感染（CRBSI），发生率与导管种类、导管相关医疗操作的频率、患者病情等因素有关。短期留置的血管内导管，皮肤定值菌通过皮下隧道移植到导管尖端，随后引发感染；长期留置的血管内导管，导管头被细菌污染，导管腔发生细菌定植，引发感染；血行传播的细菌可定值在血管内导管中，引发新的病灶。皮肤凝固酶阴性葡萄球菌定植于输液管怀疑导管相关性血流感染的患者，可采用培养方法（建议同时进行）：1.用Maki半定量培养法对血管内导管尖端片段进行培养：采集：用75%酒精消毒导管周围皮肤；移动导管，无菌剪刀剪取尖端末端5cm，直接置入无菌试管中；立即送检，防止干燥，常规培养不超过15min，4℃保存不超过2h。接种：用无菌镊子将5cm导管在血琼脂平皿上交叉滚动4次，然后弃之，放入5%二氧化碳35℃温箱。处理：若24h后血琼脂平皿生长＞15个菌落，提示有潜在导管相关性血流感染。不推荐使用增菌肉汤培养，因为增菌扩大了污染的几率，导致结果不可靠。2.采集外周静脉血培养：采集至少2份血培养，至少1份经外周静脉血穿刺采血，至少1份从导管中心或静脉留置口隔膜取血，两者之间采血时间应≤5min。Maki滚动法二、呼吸道标本咳痰途经口咽部不可避免地受到污染唾液中口咽部定植菌的浓度可达108～109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。（一）采集指征凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，并伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音，外周白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎性浸润或胸腔积液，甚至出现感染性休克和呼吸衰竭等患者，应采集痰液或下呼吸道标本。对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。（二）采集时间在抗生素应用前采集痰标本;标本采集后1～2h内必须立即进行实验室处理；咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本;取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口;深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导;对于细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续2～3天；不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检。（三）采集方法1.自然咳痰法以晨痰为佳。用清水反复漱口，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌容器中，尽快送检。否则有的细菌（如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌）在外界可能死亡。不能及时送检的标本，室温保存≤2h。要求采到肺深部的痰液，不要唾液。2.创伤性取痰方法（均由医生操作）：经支气管镜抽吸法（支气管肺泡灌洗液、防污染样本毛刷等）直接从肺部感染病灶采集高浓度的病原菌，较为安全，但不能避免咽喉部正常菌群污染。经人工气道吸引分泌物（导管吸痰、防污染灌洗等）较为采用，但人工气道常有致病菌或定值菌存在，建议采集前先做细胞血筛查。经气管穿刺吸引物采集到的下呼吸道标本不受上呼吸道污染，常用于厌氧菌培养，但患者不易接受。经胸壁针刺吸引物偶尔用于原因不明的肺炎或贴近胸壁的病灶。胃内采痰法用于结核杆菌感染的婴幼儿患者小儿取痰法用压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿受刺激后咳出分泌物。雾化取痰法无痰或痰量极少时可用，使用5%NaCl雾化导痰。哮喘患者不能用该法。痰标本的运送、保存1.标本采集后2小时内送至实验室；否则可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌死亡；2.延迟送检或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑似肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的例外），但应在24小时内处理；3.对可疑烈性呼吸道传染病（SARS、炭疽、鼠疫等）的标本，必须全过程注意生物安全；4.经口腔部污染的标本均不可以做厌氧菌培养。痰标本的处理一.痰标本的革兰染色涂片检测：其目的是判定标本是否适合做细菌培养，并初步判定有否病原菌，病原菌的数量级类别，有助于初步报告、培养基选择和培养结果的判定。一般认为来自下呼吸道的合格标本应该是含脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受唾液污染的来自于颊黏膜的扁平上皮细胞较少，其判定标准如下表：A、B级的痰标本适合进行培养；C、D级的标本须高倍镜镜下观察区分，根据视野内的白细胞或纤毛柱状上皮细胞的数量，以及细菌的种类及分布等结果进行判定；E