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第三节免疫检测1一、抗原、抗体的检测抗原抗体反应，又称血清学反应（主要指体外的反应）。（一）抗原抗体反应的特点1、特异性和交叉反应2、可逆性(分子表面的结合)非共价键结合(范德华力∝分子空间构型的互补程度、静电引力、氢键、疏水性作用)是分离纯化抗原或抗体的理论依据23、比例性和可见性比例不合适——出现游离的抗原或抗体，小分子的免疫复合物形成，加电解质也不可见；比例合适——出现网格状的大复合物，游离的抗原或抗体少，加电解质，可见；因此，在抗原抗体反应中，为得到肉眼可见的反应现象，需要调整抗原、抗体的比例。4、阶段性①抗原抗体特异性结合阶段，短②可见反应阶段，长34抗原抗体反应的主要影响因素1、抗原和抗体浓度、比例2、电解质在可见反应阶段发挥作用，0.85%NaCl。3、温度常选用37度，也有4度。4、pH一般在pH6~8。5（二）血清学反应的种类1、凝集反应（agglutinationreaction）概念：颗粒性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集块的反应。反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。61、颗粒性抗原＋抗体直接凝集类别及应用：7玻片法8血凝反应强度示意图9试管法例：伤寒杆菌的诊断——肥达试验10可溶性抗原＋相应抗体不凝集2、可溶性抗原-无关载体＋抗体间接凝集正向反向11•常用载体——RBC、聚苯乙烯乳胶、活性碳、胶体金123、待测可溶性抗原＋抗体+可溶性抗原-无关载体间接凝集抑制13（二）沉淀反应（percipitationreaction）概念：沉淀原、沉淀素类别及应用：1、液体内的沉淀实验——环状沉淀反应、絮状沉淀反应2、凝胶内的沉淀反应——常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。3、免疫浊度试验14AbAg环状沉淀示意图•沉淀管内径1.5～2mm•1～5min出现沉淀环为阳性•30min不出现沉淀环为阴性151:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管轻摇絮状沉示意图淀AgAbAg16单扩17火箭电泳1819双向免疫扩散20双扩本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。21“1”为单一抗原抗体系统。“n”为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。221.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。3.可进行任意稀释。23对流免疫电泳24免疫电泳常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。25（三）补体结合试验概念：组成：待检系统、指示系统2627（四）中和试验①病毒中和试验血清＋病毒＋细胞细胞是否感染②毒素中和试验血清＋外毒素毒素活性作用是否丧失2829（五）免疫标记测定技术概念：用具有高敏感度的标记物，标记抗体或抗原后进行的抗原抗体反应。分类：免疫组化技术、免疫测定常用标记物：酶、荧光素、同位素、胶体金等30大鼠VSMC平滑肌特异性α-Actin免疫组化染色照片31间接免疫荧光法检测自身抗体和病原体抗体321、免疫酶标记技术用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应。以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。(1)常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）(2)常用方法：酶联免疫吸附试验33ELISA原理示意图34间接法35双抗夹心法36抗原竞争法37免疫荧光技术常用荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）FITC,495nm2、罗丹明（红色荧光）RB2003、R—藻红蛋白R-PE38免疫荧光技术（可在同一标本中测多个抗原或抗体）39放射免疫分析法–同位素分析的灵敏性＋抗原抗体反应的特异性–优点：灵敏度高特异性强精确性好样品用量少测定方法规范、自动化–常用同位素：125I、131I、3H、14C、32P40放射免疫测定WESTERN原理41免疫胶体金技术4243444546快速斑点免疫金渗滤法检测示意图47•常用抗原抗体反应的相对敏感度（/L）•血清蛋白电泳（区带电泳）1000mg•免疫电泳50～100mg•单向免疫扩散〈10～20mg•双向免疫扩散〈10mg•火箭电泳〈5.0mg•对流免疫电泳〈1.0mg•免疫比浊1.0mg•补体结合反应10ug•凝集反应10ug•ELISA〈10ug•RIA〈10ug48二、免疫细胞的检测在体外或体内，对机体免疫细胞进行鉴定、计数、功能测定。1、免疫细胞的分离自然沉降法密度梯度离心+花环试验（或黏附试验等）免疫磁珠法图流式细胞分离术图等49Percoll分层液5051流式细胞仪分离细胞52•2、免疫细胞的计数•图各种血细胞1.2.3.单核细胞4.5.6.淋巴细胞7.8.9.10.11.中性粒细胞12.13.14.嗜酸性粒细胞15.嗜酸性粒细胞16.红细胞17.血小板.53流式细胞仪检测细胞表面标记54553、免疫细胞功能的测定(1)淋巴细胞转化试验形态学方法、淋巴母细胞计数、3H-胸腺嘧啶核苷掺入法、MTT检测法等(2)细胞毒试验CTL、NK、LAK细胞等混合淋巴细胞培养(3)T细胞功能的体内检测（迟发型超敏反应）皮肤试验、接触性过敏反应5、细胞因子检测ELISA、生物活性测定、PCR5657