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原代神经细胞培养原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期贴附生长型细胞必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞悬浮生长型细胞不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞培养细胞的生长方式及类型贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板悬浮生长型细胞每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白先吸附于底物上，悬浮细胞再与底物附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性原代神经细胞培养操作步骤1.超净台紫外灯照射消毒，至少30分钟，开恒温水浴箱至37℃2.取出高糖DMEM、FBS、胰蛋白酶复温。3.取新生鼠1只，0.5%的碘伏消毒，断头，取整脑于含5ml的DMEM液培养皿中，分离大脑皮质于含1mlDMEM液的另一培养皿（培养皿均置于冰盒上)。4.弯头剪刀尽可能剪碎组织。5.向剪碎的组织中另加DMEM4ml，全部吸入离心管，加5ml胰蛋白酶。6.置37℃水浴中15分钟。7.加含10%FBS的DMEM10ml，吸管轻匀吹打，尽量使组织分散。8.离心1500rpn，5分钟。9.弃上清，加10mlDMEM10%FBS，吸管轻匀吹打，200目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。10.以105的接种于培养瓶中，标记后置37℃，含5%CO2培养箱培养。11.12-24小时后，换液观察。细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数计数原则：计上不计下，计左不计右。细胞数（ml）＝4大格细胞总数/4×10000注意：镜下由两个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计算在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。注意事项：无菌操作原则培养细胞生长的条件细胞的营养需要（培养基，血清，添加因子等）细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压无污染无毒无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。无污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染细菌霉菌支原体等细菌污染能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致细胞崩解死亡。细菌污染霉菌污染荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体扫描电镜法显示支原体附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体细胞传代培养培养细胞的生长过程单个细胞的生长过程细胞系的生长过程细胞周期间期M期（有丝分裂期）G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）细胞系的生长过程原代培养期传代期衰退期为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。传代培养当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞的代数，一般细胞的代数为50代。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中的培养液。2.用无钙镁离子的PBS清洗细胞3遍.3.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置1-2min（显微镜下动态监测）。4.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。5.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。6.吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。7.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。8.将后者放入培养箱中培养。细胞冻存与复苏细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。细胞冻存方法1.预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO2.取对数生长期细胞，PBS清洗3遍3.胰酶消化，离心弃上清，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4年后，存活率可达80％－100％。DMSO液用培养液提前配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大。大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶（让冰晶快速升华）。慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。